血小板中hsa_circ_0060079的生物信息学分析与验证

郝秀芳 俞露 邓刚

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类高度保守、高稳定性的非编码RNA，可作为miRNA 海绵通过吸附miRNA 调控其靶基因的表达，从而调控其他相关RNA 的表达水平[1]。circRNA 呈封闭环状结构，不受RNA 外切酶影响，表达更稳定，不易降解。近年的研究表明，circRNA 分子富含miRNA 结合位点，在细胞中起到miRNA 海绵的作用，能阻断或降低miRNA 对基因的抑制作用，从而促进靶基因的表达[2]。在前期研究中，发现血小板中存在多种凋亡相关miRNA[3]，其中miR-326 可通过靶向Bcl-xL 诱导血小板凋亡[4]。circRNA 以竞争性内源RNA 方式结合miRNA 影响其对靶基因的抑制作用。本次研究采用miR-326 seeds 互补序列CCCAGAG，对circbank 数据库中的circRNA 序列进行反向检索，分析发现hsa_circ_0060079 具有42 个miR-326 的结合位点，可能以miRNA 海绵形式调控miR-326 影响血小板凋亡。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 研究起止时间为2019 年3 月至2021 年5 月，在宁波市中心血站进行本次研究。血小板来源于无偿献血志愿者。

1.2 生物信息学分析 通过circBASE 数据库获取hsa_circ_0060079 的序列信息。利用在线microRNA预测工具（genie.weizmann.ac.il/ pubs/ mir07/mir07_prediction.html）分析hsa_circ_0060079剪接序列中miR-326 的可结合位点数，并计算hsa_circ_0060079 对于miR-326 的吸附效能，即miRNA 可结合位点数目×miRNA 序列长度/circRNA 序列长度。通过CircSponge 数据库，分析hsa_circ_0060079 与RNA 结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）的互作网络。

1.3 血小板中hsa_circ_0060079 的检测

1.3.1 血小板的纯化及RNA 的提取 机采血小板中含有少量白细胞及红细胞，采用抗白细胞特异性抗原CD45 免疫磁珠和抗红细胞特异性抗原CD235免疫磁珠，通过反向分选法纯化血小板。流式细胞仪鉴定CD61阳性细胞（血小板）＞99%，CD235阳性细胞（红细胞）及CD45 阳性细胞均＜0.5%。纯化的血小板采用Trizol提取总RNA。

1.3.2 PCR 验证 为明确血小板中是否存在hsa_circ_0060079，通过在线网站https：//circinteractome.nia.nih.gov，针对circRNA 全长序列设计divergent 引物及convergent 引物，序列信息详见表1。对血小板总RNA进行Rnase R消化后（37 ℃孵育3 h），采用随机六聚体引物合成cDNA，使用divergent 引物及convergent引物进行PCR验证。

表1 引物序列

1.4 hsa_circ_0060079 结合miR-326 的双荧光素酶实验 根据circRNA-PLT01 与miR-326 结合序列的信息，设计目标序列和突变序列，化学合成目的基因片段，合成时在目的片段两端加上XhoI、NotI酶切位点。合成的基因片段平端克隆到PUC57 载体，然后测序验证。分别采用XhoI 和NotI 对目的片段载体及psiCHECK-2 载体双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）并回收酶切产物，T4 DNA Ligase 连接目的片段与的psi-CHECK-2 载体。将连接产物转化DH5α 感受态细胞，接种于含氨苄青霉素的Luri-Bertani 平板，37 ℃生化培养箱过夜培养。筛选阳性克隆并经XhoI+NotI 双酶切电泳鉴定及测序验证。人工合成miR-326 及miR-NC（阴性对照），与上述构建成功的质粒以lipofectamineTM2 000共转染MEG01细胞，每组3个平行孔，通过观察荧光变化明确circRNA-0060079与miR-326的结合情况。

2 结果

2.1 靶向miR-326 的circRNA 生物信息学预测hsa_circ_0060079 剪接序列长度为3603 bp，位于chr20：34082350-34092833，来源于CEP250 基因（RefSeq：NM_007186），包含有42 个miR-326 可结合位点数，circ-0060079 的结合效能0.26，其结合效能接近于小鼠体内经典的miRNA 海绵的结合效能0.31。推测hsa_circ_0060079 与miR-326 具有较高的结合效率，具备成为miRNA 海绵的结构基础。

2.2 hsa_circ_0060079的RBPs分析见图1

图1 hsa_circ_0060079的RBPs分析图

由图1 可见，hsa_circ_0060079 可与12 个常见的RBPs 发生相互作用，但hsa 结合力普遍不高，其结合位点均为1 个。

2.3 血小板中hsa_circ_0060079 的检测结果见图2

由图2 可见，血小板及巨核细胞系MEPG01 中存在引物convergent primer 及divergent primer 的特异性扩增产物，证实血小板及巨核细胞系MEPG01中存在有hsa_circ_0060079的表达。

图2 hsa_circ_0060079 PCR验证实验电泳结果及引物设计示意图

2.4 双荧光素酶检测结果 双荧光素酶检测hsa_circ_0060079与miR-326有着较高的结合效率。

3 讨论

近年来，凋亡作为血小板的死亡方式逐渐被学者所认识[5,6]，研究发现无论血小板还是巨核细胞，其凋亡主要由线粒体介导的内始式途径调控[7]。线粒体凋亡途径取决于Bcl-2 家族促凋亡因子Bak/Bax与抗凋亡因子Bcl-xL 之间的平衡[8]，其中Bcl-xL 被认为是内始式凋亡途径的分子开关，是血小板存活的关键调控蛋白，它可以通过与Bak/Bax（促凋亡因子）结合抑制细胞凋亡，而抑制Bcl-xL 则可以诱导血小板凋亡[9]。

Hansen 等[7]研究发现剪接序列长度为1485 nt的环状RNA-CDR1as（也称为ciRS-7），在其序列上有超过60 个保守的miR-7结合位点，因此起到有效的miR-7“海绵”作用，影响miR-7 靶基因活性。此外，序列长度为1188 nt，含有16 个miR-138 结合位点的的ci-Sry 也被证实起到miR-138 海绵作用。研究表明，circRNA 可以miRNA 海绵的方式结合miRNA 影响其对靶基因的抑制作用，且circRNA 对特定miRNA 的海绵效应可能与其剪接序列长度及相应的miRNA可结合位点数目密切相关。

血小板中是否存在可高效吸附miR-326 的circRNA？研究通过circRNA-seq 发现血小板中存在着大量的circRNAs，通过find_circ 软件分析共找到34175 个circRNA，约70%与已知报道的circRNA 一致（与circBank 数据库比对）。进一步采用生物信息学分析找出包含有miR-326 seeds 互补序列CCCAGAG 的circRNAs，采用Online microRNA prediction tool 分析上述circRNAs 拼接序列中miR-326可结合位点数，发现hsa_circ_0060079，拼接序列长度为3603 bp，包含有42 个miR-326可结合位点数，推测hsa_circ_0060079 与miR-326 可能具有较高的结合效率。进一步检测发现在血小板及巨核细胞系MEG01 细胞中均有circRNA-0060079，而RBPs 网络分析表明hsa_circ_0060079可能并不是通过与RBPs相互作用的方式发挥作用，可能还是以miRNA 海绵方式来抑制miRNA 功能参与血小板的功能调控。进一步通过双荧光素酶实验证实hsa_circ_0060079与miR-326 具有相互作用，有着较高的结合效率。由此提出circRNA-0060079 有可能通过miRNA sponge 形式调控miR-326，进而影响Bcl-xL 表达在ITP病理机制中发挥重要作用。

目前，circRNAs 的研究已成为研究热点，被认为是理想的生物标志物，但对于血小板circRNA 的相关研究尚有很多不足。高纯度的血小板是成功检测到血小板circRNA 前提条件，本次研究采用免疫磁珠反向筛选去除了富血小板血浆中混杂的红细胞与白细胞，确保了结果的可靠性。本次研究对circRNA-0060079 进行了初步鉴定和生物信息学分析，但对于circRNA-0060079 在血小板中的具体作用尚有待进一步深入研究，尚不清楚circRNA-0060079 是否只是mRNA 降解的产物，其表达情况是否与种族、性别、年龄、健康状况相关。在今后研究中将通过构建circRNA-0060079 过表达载体和血小板凋亡模型，通过相关实验进一步证实其对血小板凋亡基因调控，从而探讨其是否可能成为免疫性血小板减少症紫癫靶向治疗的新工具。