高强度聚焦超声联合脂质纳米氟碳液滴消融兔肝的实验研究

孙廷宇 王 琦 叶合敏 曾 超 李婧男 李发琪

高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）是一种靶向、无创的肿瘤消融方法，但对于体积较大、血供丰富的肿瘤，其治疗时间相对较长、有效率较低［1］。研究［2］表明，氟碳液滴可以通过HIFU 的热效应在体内相变为微泡，改变组织的声学特性增强声散射，以及增强能量在靶区的聚集，从而提高HIFU 的治疗有效率。HIFU 联合氟碳液滴增效机制的应用已有文献［3］报道，但其体内空化活动变化及术后组织再生的病理过程鲜有报道，同时空化效应过度可能会造成不必要的损伤［4］。基于此，本实验对比分析单纯HIFU 及其联合脂质纳米氟碳液滴（lipid-perfluorocarbon nanodroplets，L-PFP）消融兔肝的空化活动和病理变化，旨在为氟碳液滴用于HIFU 临床治疗肝肿瘤提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物

新西兰大白兔24只（由重庆医科大学动物实验中心提供），雌雄不限，体质量2.5～3.2 kg；本实验经重庆医科大学动物伦理委员会批准（批准号：SCXK 2012-0001）。

二、主要实验仪器与试剂

1.仪器：透射电子显微镜（JEM-1400PLUS，日本电子株式会社）；马尔文激光粒径仪（Zeta Sizer 3000HS，英国马尔文仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52AA，亚荣生化仪器厂）；超声处理器（VCX150，美国Sonic 公司）；海扶刀®聚焦超声肿瘤治疗系统（JC 200，重庆海扶医疗科技股份有限公司）；被动空化检测（PCD）系统配备的平面压电换能器（panametrics V309-SU，中心频率5 MHz，美国泛美公司），超高速数据采集卡（PXIe-5122，美国国家仪器公司），LabVIEW开发平台（v2015，美国国家仪器公司）。

2.试剂：棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、磷脂PEG 马来酰亚胺（DSPE）、胆固醇均购自美国Avanti 公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国HyClone 公司；全氟戊烷、氯仿均购自中国阿拉丁公司；戊巴比妥购自北京化学试剂公司；全氟戊烷（PFP）购自美国Stream Chemical公司。

三、实验方法

1.L-PFP 的制备：将6 mg DPPC、2 mg DSPE、2 mg胆固醇及5 ml 氯仿加入圆底烧瓶均匀混合，然后使用旋转蒸发仪加热蒸发，直至底部生成均匀的脂质薄膜；加入5 ml PBS（pH 值7.4）收集脂质体。冰浴下将200 μl PFP 加入脂质体中，使用超声处理器（声功率130 W，处理时间120 s，超声频率20 kHz，占空比45%）对混合溶液进行乳化，制得L-PFP，低温离心后置于4℃冰箱中保存备用。

2.HIFU消融：实验前所有动物禁食24 h，随机分为对照组（单纯HIFU 组）和联合组（L-PFP 联合HIFU），每组各12只。联合组经耳缘静脉注射3%戊巴比妥溶液用于麻醉兔（1 ml/kg），注射L-PFP（0.8 ml/kg），1 min后应用超声确定其肝脏位置，并使用聚焦超声肿瘤治疗系统以能量900 J的连续波进行HIFU辐照。对照组麻醉后仅以相同参数进行HIFU 辐照。观察两组强回声区范围，使用HIFU 自带的GreyAnalyse 软件勾画感兴趣区并计算灰度变化值。

3.空化检测：应用HIFU 自带的超声成像系统对比分析辐照前后兔肝组织的回声变化；应用PCD 系统检测空化特征信号，并根据空化信号的宽带噪声（root mean square，RMS）曲线规律计算累积瞬态空化剂量［5］。

4.实验室及病理检查：两组兔均于辐照前1 d和辐照后即刻、1 d、3 d、7 d 行心脏采血检测谷丙转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）。分别于HIFU辐照后即刻、1 d、3 d、7 d将消融的兔肝取出体外，观察大体标本。取消融区、交界区及周围区（距消融区边缘3 mm以外）组织，以4%甲醛固定、石蜡包埋、切片，HE 染色后进行病理观察。

四、统计学处理

应用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以x±s表示，组间两两比较行LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、L-PFP物化表征

L-PFP 溶液呈乳白色，静置过夜后分层，上层为透明液体，下层为乳白色沉淀。马尔文激光粒径仪测得L-PFP 粒径为（278.33±26.06）nm，透射电子显微镜显示脂质体成功包载PFP（图1）；制备的L-PFP 24 h 内粒径无明显变化，稳定性良好。

图1 L-PFP透射电镜图

二、HIFU消融情况

使用聚焦超声肿瘤治疗系统以900 J能量辐照后，对照组与联合组均出现强回声，辐照区域边界清晰，联合组强回声区范围大于对照组。对照组和联合组灰度变化值分别为45.60±4.07和88.00±7.21，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 对照组与联合组辐照前后超声图像

三、空化检测结果

HIFU辐照过程中两组RMS均总体增强，且随时间波动，联合组RMS 高于对照组（P＜0.05）。联合组累积瞬态空化剂量为0.69±0.07，显著高于对照组0.11±0.01，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 两组HIFU辐照过程中RMS变化情况

四、大体标本变化情况

联合组与对照组病灶辐照后即刻呈现椭圆形，中心区域可见组织坏死，与正常肝组织分界清晰，交界处可见充血带，联合组消融灶显著大于对照组。辐照后1 d 两组中心区域均呈凝固性坏死，对照组充血带消失，联合组充血带减小；辐照后3 d 对照组表现为中心组织坏死，周围出现白色炎症反应带，联合组表现为中心组织坏死，充血带消失，未见炎症反应带出现；辐照后7 d 对照组可见消融灶消失，联合组可见中心组织坏死，周围伴一层白色炎症反应带。见图4。

图4 对照组与联合组辐照后各时间点消融灶大体图

五、实验室检查结果

联合组与对照组辐照后即刻、1 d、3 d、7 d ALT 和AST均呈先增高后降低的趋势，联合组辐照后1 d、3 d、7 d ALT 和AST 均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 HIFU辐照前后兔肝功能指标变化情况（x±s） U/L

六、病理检查结果

联合组辐照后即刻消融区域与正常组织边界清晰，消融区域内肝组织明显破坏，肝细胞完全消失，被大量红染的蛋白物质代替，可见细胞碎裂；辐照后1 d消融区域边界周围伴有大量炎性细胞浸润，消融区域与正常组织边界清晰；辐照后3 d 消融区域边界出现条带状纤维化，消融区域与正常组织边界清晰；辐照后7 d 消融区域边缘可见较多正常肝细胞，并伴有条带状纤维化及少量炎性细胞浸润。对照组辐照后即刻消融区域边界较模糊，可见淤血和局部肿胀，其内肝细胞破坏不彻底；辐照后1 d 可见炎性细胞浸润，边界较清晰；辐照后3 d 消融区域边缘可见较多正常肝细胞，同时伴有条带状纤维化及少量炎性细胞浸润；辐照后7 d消融灶消失，恢复为正常肝组织。见图5。

图5 对照组与联合组HIFU辐照后各时间点肝组织病理图（HE染色，×100）

讨论

HIFU是一种安全、有效、无创的肝肿瘤消融疗法，其辐照过程中产生的超声高回声和RMS 变化与其引起的空化效应密切相关［6-7］。肝组织血供丰富，消融时产生的能量易被血流阻挡或随传播深度增加发生声衰减，以及因靶区密度不均匀而不易沉积等［8］，严重影响了HIFU 的消融效果。因此，降低声阻抗，改善组织声环境，使超声能量有效沉积于靶区，是目前HIFU 研究的热点。

氟碳液滴常温下为液态，当温度升高或超声辐照时在体内相变为微泡，可以改变组织的声学特性，增强能量沉积，从而增强HIFU 的消融效果［9］。He 等［10］采用载全氟己烷的富勒烯纳米球增效HIFU 治疗离体牛肝时发现，与单纯HIFU 组比较，纳米球组凝固性坏死体积增大了约1.2 倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。丁晓亚等［11］将离体牛肝分为不同浓度包覆PFP 的介孔氧化硅微球组，使用HIFU 辐照后发现随着微球浓度增高，凝固性坏死体积也随之增加。表明氟碳液滴对HIFU 有增效作用，但并未进一步在动物体内进行验证并探讨其增效机制。

本实验采用薄膜水化法成功制备L-PFP，然后联合HIFU 辐照兔肝。结果表明辐照后对照组和联合组灰度变化值分别为45.60±4.07 和88.00±7.21，累积瞬态空化剂量分别为0.11±0.01 和0.69±0.07，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。表明L-PFP 联合HIFU 可以引起更强烈的空化泡群，空化效应显著增强。两组辐照后1 d ALT 和AST 均较术前显著增高且随时间降低，联合组辐照后1 d、3 d、7 d ALT 和AST 均明显高于对照组（均P＜0.05），对照组辐照前与辐照后7 d 比较差异无统计学意义，说明对照组辐照后7 d 时消融灶损伤修复完全或损伤不明显，表明两组均产生肝组织损伤和修复，L-PFP 提高了HIFU 对肝组织的损伤效果。本研究大体标本及病理检查显示，联合组较对照组造成消融区域的肝细胞损伤和肝淤血现象更严重；随着时间推移，两组均出现充血水肿，并在消融灶周围形成肉芽组织，纤维组织增生，消融灶缩小。无论是解剖坏死范围还是损伤修复时间，联合组均明显大于对照组，证明L-PFP 在动物体内对HIFU 消融肝组织有增效作用。

综上所述，L-PFP 联合HIFU 消融时，空化效应显著增强，对肝脏的消融效果明显提高，消融灶修复时间延长，为探讨氟碳液滴增效HIFU 在临床上的应用提供了实验依据。但本实验仅探讨了氟碳液滴对HIFU消融正常兔肝的空化活动及病理变化，其对热效应及肝肿瘤模型的影响仍需今后进一步研究。