基于免疫组化的膀胱浸润性尿路上皮癌的分子分型

祝 颖，蒋智铭，周 隽，徐耀庭，邹 强，王 洋，陈春燕，茅培青，陈艺琳

膀胱浸润性尿路上皮癌是一种高度异质性肿瘤，其分子和免疫表型、组织学形态、临床预后以及对治疗的反应均存在显著个体差异，目前缺乏可用于精准化治疗的靶向药物。膀胱浸润性尿路上皮癌的分子分型目前尚无统一标准[1-2]。研究发现膀胱浸润性尿路上皮癌具有类似乳腺癌的分子亚型特征，包括2种亚型：腔面型和基底样型，有学者认为可用免疫组化法进行初步分型[3-5]，但目前尚无可参考的诊断标准。此外，膀胱浸润性尿路上皮癌各组织学变异和浸润性尿路上皮癌的分子分型之间存在一定的相关性[6-7]。本文通过对197例膀胱浸润性尿路上皮癌的9种常用免疫组化标记进行分析，探讨通过免疫组化法对膀胱浸润性尿路上皮癌进行分子分型的可操作性诊断标准。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2010年6月～2020年6月上海第六人民医院病理科及上海市第四人民医院病理科存档的膀胱浸润性尿路上皮癌197例。所有病例均有完整的临床病理资料，其中男性167例，女性30例，年龄45～90岁，中位年龄74岁。其中139例(70.6%)为膀胱肿瘤电切标本，58例(29.4%)为膀胱癌根治性标本。由于膀胱浅表性尿路上皮癌与肌层浸润性尿路上皮癌属于两条不同的癌变通路[8]，二者的免疫表型存在差异，本实验入组病例包括了两种标本：(1)有明确肌层浸润的尿路上皮癌173例；(2)有黏膜下广泛浸润，因没有切到肌层而难以判断是否有肌层浸润的尿路上皮癌24例。本实验明确排除了以外生性乳头状尿路上皮癌成分为主伴局部黏膜下浸润的癌，以及以推进式生长为主的内翻性尿路上皮癌。所有病例切片均经两名副高级以上职称病理医师重新阅片确诊。

除普通型癌外，膀胱浸润性尿路上皮癌的组织学变异按WHO和相关文献标准[9-10]分为：腺样变异、鳞样变异、微乳头变异、浆细胞样变异(包括印戒细胞样变异和弥漫型变异)、巢状变异、肉瘤样变异。浸润性尿路上皮癌的各种形态学变异常和普通型癌合并存在，本实验入组的变异型癌肿瘤量至少大于肿瘤总量的20%，并单独统计其免疫表型。

1.2 主要试剂及方法所有标本均经10%中性福尔马林固定后脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察。每个病例选1～2个浸润性癌组织块行CK7、GATA3、FOXA1、CK20、CK14、CD44、CK5/6、p53、Ki-67等9种尿路上皮癌常用免疫组化标记。免疫组化采用EnVision两步法，每组实验均设置阳性和阴性质控。所有一抗、二抗均购自福州迈新公司，采用Leica自动免疫组化机检测，少数病例加做vimentin、CK(AE1/AE3)、HCK、uroplakinII等其它标记。

1.3 免疫组化结果判断免疫组化结果判读：≥60%浸润性癌细胞阳性定为()；10%～59%的浸润性癌细胞阳性定为(+)；<10%的浸润性癌细胞阳性定为(-)。参考相关文献[3-5]制定的膀胱浸润性尿路上皮癌基于免疫组化的分子分型标准：(1)纯腔面型癌，FOXA1、CK20至少一项为阳性(+/)，CK14、CD44、CK5/6均(-)；(2)腔面为主型癌，FOXA1、CK20至少一项为()，CK14、CD44、CK5/6不超过一项阳性，且阳性细胞数不超过(+)；(3)纯基底样癌，CK14、CD44、CK5/6至少一项为阳性(+/)，FOXA1和CK20均(-)；(4)基底为主型癌，CK14、CD44、CK5/6至少一项为()，FOXA1、CK20不超过一项阳性，且阳性细胞数不超过(+)；(5)难以分型癌，指腔面型和基底型标记超过上述程度的阳性重叠，或全部阴性的浸润性尿路上皮癌。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验和Fisher精确概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浸润性尿路上皮癌的免疫表型197例膀胱浸润性尿路上皮癌中GATA3、CK7、p63、p40阳性例数分别为171(86.8%)、168(85.3%)、171(86.8%)、148(75.1%)，阳性率均大于75%，其表达均与肿瘤的分子分型无关。

根据本组摸索的分子分型免疫组化分型标准，197例膀胱浸润性尿路上皮癌中，纯腔面型73例，腔面为主型32例，共105例，占53.3%；纯基底样型56例，基底为主型14例，共70例，占35.5%；难以分型22例，占11.2%。FOXA1和CK20的阳性率分别为53.5%(105/197)、57.9%(114/197)，在腔面型癌中的阳性率分别为75.9%(82/105)、86.7%(91/105)，腔面型癌的2种免疫标记FOXA1和CK20表达呈正相关(P<0.001)。CK14、CD44、CK5/6的阳性率分别为30.5%(60/197)、51.8%(102/197)、39.6%(78/197)，在基底样型癌中的阳性率分别为67.1%(47/70)、91.4%(64/70)、77.1%(54/70)，基底样型癌的3种免疫标记CK14、CD44和CK5/6表达呈正相关(P<0.001)。基底样型癌和腔面型癌的免疫标记表达呈负相关(P<0.001)。相关蛋白表达与分子分型有较好的一致性(P<0.001，表1)。

表1 5种免疫标记与浸润性尿路上皮癌分子分型的相关性

2.2 各种组织学变异膀胱浸润性尿路上皮癌的分子分型197例膀胱浸润性尿路上皮癌中，普通型癌112例(56.9%)，腺样变异28例(14.2%)，鳞样变异20例(10.2%)，微乳头变异11例(5.6%)，浆细胞样变异12例(6.1%)，巢状变异5例(2.5%)，肉瘤样变异9例(4.6%)。85例有组织学变异癌中，53例(62.4%)伴有数量不等的普通型癌。112例普通型癌中，腔面型61例(61/112，54.5%)，基底样型34例(34/112，30.4%)，难以分型17例(17/112，15.2%)，无明显相关性。在85例有组织学变异癌中，腺样、微乳头、浆细胞样和巢状变异的癌明显多为腔面型癌(图1、2)，约占76.8%(43/56)，其比例分别为78.6%(22/28)、90.9%(10/11)、66.7%(8/12)、60.0%(3/5)；鳞样和肉瘤样变异的癌明显多为基底样型癌(图3)，约占93.1%(27/29)，其比例分别为95.0%(19/20)、88.9%(8/9)，尿路上皮癌的组织学变异与分子分型存在显著相关性(P<0.001，表2)。组织学变异癌中难以分型的5例均为不同的组织学变异，无明显相关性。

图1 膀胱浸润性尿路上皮癌，腺样变异，腔面型癌：A.HE染色；B.CK14阴性，EnVision法；C.FOXA1阳性(2+)，EnVision两步法 图2 膀胱浸润性尿路上皮癌，巢状变异，腔面型癌：CK20阳性(2+)，EnVision两步法 图3 膀胱浸润性尿路上皮癌，鳞样变异，基底样型癌：A.HE染色；B.CD44阳性(2+)，EnVision两步法

表2 膀胱浸润性尿路上皮癌分子分型与组织学变异的相关性

2.3 预后本组有随访资料的共116例，81例失访，随访时间13～65个月。其中死亡15例，复发32例，无复发者69例。死亡病例中腔面型癌8例(8/64)，基底样型癌6例(6/38)，难以分型1例(1/14)，差异无统计学意义(P>0.05)。复发病例中，腔面型癌14例(14/64)，基底样型癌14例(14/38)，难以分型癌4例(4/14)，基底样型癌的复发率略高，侵袭性略强，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

肌层浸润性尿路上皮癌的总体预后差，并缺乏个体化治疗的病理参数，因此目前对膀胱浸润性尿路上皮癌分子分型的研究主要集中在肌层浸润性癌方面，但尚无统一的标准。其中比较有代表性的有两种：(1)Lund大学的分子分型[11]依据不同的基因表达谱，提出5种不同的分子亚型(分别是Urobasal A型、Urobasal B型、遗传学不稳定型、鳞状细胞癌样型和异质性浸润型)；(2)TCGA(The Cancer Genome Atlas)分型[12]：依据对肌层浸润癌的基因突变、易位融合和RNA测序分为5种亚型(分别是腔面-乳头型、腔面-浸润型、腔面型、基底-鳞状型和神经型)。此外，还有多名学者提出许多不同的分型[13-14]。

在对膀胱浸润性尿路上皮癌分子分型的研究发现，这类高度恶性又高度异质性的肿瘤有类似浸润性乳腺癌的特征，可用免疫组化法大致分为腔面型癌和基底样型癌两大基本类型。在良性尿路上皮和浅表性尿路上皮癌中，靠近腔面的尿路上皮细胞CK20、FOXA1表达强度较高，属于腔面型标记；而靠近基底层的细胞CK14、CK5/6、CD44表达强度较高，属于基底型标记。膀胱浸润性尿路上皮癌由于基因改变类型不同，肿瘤的免疫表型会出现明显差异，有的浸润癌基底型标记大量丢失，而腔面型标记得以保留；有的则相反，腔面型标记大量丢失，而基底型标记得以保留。

在本组膀胱浸润性尿路上皮癌中，虽然CK7、GATA3、p63、p40表达有时也会丢失，但总的阳性率都达75%～86%，因此这4项标记并不适合用于分子分型。根据文献[3-6]选择相关性较好的FOXA1和CK20作为腔面型癌标记，CK14、CK5/6和CD44作为基底样型癌标记。即使这样仍有一部分癌两类标记会有轻度重叠，为此我们将腔面型癌分为两组，一组是纯腔面型癌(Ⅰ型)，FOXA1和(或)CK20至少一项为阳性(+/)，而CK14、CK5/6、CD44均(-)，共73例；另一组是腔面为主型(Ⅱ型)，FOXA1和(或)CK20至少一项为()，CK14、CK5/6、CD44不超过一项阳性，且阳性细胞数不超过(+)，共32例。同样将基底样型癌也分为两组，一组是纯基底样癌(Ⅲ型)，CK14、CK5/6、CD44至少一项为阳性(+/)，FOXA1和CK20均(-)，共56例；另一组为基底为主型癌(Ⅳ型)，CK14、CK5/6、CD44至少一项为()，腔面型标记FOXA1和(或)CK20不超过一项阳性，阳性细胞数不超过(+)，共14例。剩余22例为不能分型癌(Ⅴ型)，大多数(20例)是腔面型和基底样型标记重叠程度超过上述Ⅱ型和Ⅳ型标准；还有少数是分化很差的癌，上述5项标记均阴性，但临床、组织学形态和其它免疫标记如CK7、GATA3仍能证实其为膀胱浸润性尿路上皮癌(共2例)。本组实验结果显示：88.8%(175/197)的膀胱浸润性尿路上皮癌可以用本组设定的标准，用免疫组化法分为腔面型和基底样型两大基本类型。部分难以分型癌(Ⅴ型)产生的原因可能有一部分癌在分子水平就有腔面型癌和基底样型癌的交叉重叠，因此在免疫表型上也产生重叠，而这一推测要通过基因检测来证实；另一种可能是本组在选样上产生的误差，即有少数入组病例可能属于T1期非肌层浸润癌。

文献报道膀胱浸润性尿路上皮癌不同组织学变异与分子分型有一定的相关性[6-7]。以本研究统计学结果来看，腺样、微乳头、浆细胞样和巢状变异的癌明显以腔面型癌为主，尤其是前两种亚型，占比>75%，而鳞样、肉瘤样变异的癌则以基底样型癌为主，占比>85%，这与基底样型癌容易发生鳞化和上皮-间质转化的生物学特征有关。本研究结果提示膀胱尿路上皮癌的组织学变异与分子分型有明显相关性，其特殊的组织学变异可以提示其分子分型。

应用免疫组化方法对浸润性乳腺癌进行分子分型，对临床采用内分泌治疗、靶向治疗还是化疗有直接指导意义，而膀胱浸润性尿路上皮癌的分子分型尚处于研究之中，其临床意义还不能与乳腺癌相比。目前已有文献提出，不同分子分型对PD-L1免疫治疗和化疗的敏感性有差异[15-16]。本组结果发现以鳞样、肉瘤样变异为主的基底样型癌复发率略高，侵袭性略强，提示基于免疫组化方法的分子分型可能有助于临床治疗方案的选择。目前就国内大多数医院病理科来说，对浸润性尿路上皮癌进行基因突变、易位融合、DNA和RNA测序等全方位检测是无力实现的，也缺乏公认的标准。

综上，本文根据197例膀胱浸润性尿路上皮癌的常规免疫标记检测结果，提出了一种基于免疫组化方法的分子分型标准，可以在对膀胱浸润性尿路上皮癌作病理诊断的同时，又对其可能的分子分型(属于腔面型还是基底样型)作出初步分析，是一种简便、可重复的方法。