肺泡灌洗液与血清GM试验在侵袭性肺曲霉菌病中的诊断判定评价

袁立志,孟凡珍，崔 华,尹 梅，周 玮

侵袭性肺曲霉病(IPA)主要发生于免疫功能障碍或有多种基础疾病的患者,病死率可达60%以上[1],其临床表现不典型、特异性不高，胸部影像学表现多变，不利于早期诊断，严重影响患者的预后。组织病理学是IPA诊断的金标准，但获取标本困难限制了它在临床的广泛应用。微生物检测，易受标本合格与否、运送过程是否有污染等多种因素的干扰，其敏感度不高，仅为30%～50%[2-3]。真菌抗原检测技术目前已在临床中广泛应用，半乳甘露聚糖(GM)是曲霉菌细胞壁上的一种重要成分，可早期释放于体液，对于IPA的早期诊断具有一定的特异性和敏感性。本研究通过分析拟诊IPA患者的BALF与血清两种标本的GM实验结果，结合真菌培养，探讨两种标本在 IPA诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2018年1月至2020年12月入住宁夏医科大学总医院及其分支医院各个科室的拟诊肺部真菌感染住院患者374例，其中男性214例，女性160例，年龄41～78岁。所有患者均接受血清GM试验、肺泡灌洗液真菌培养及GM试验检查。入选标准：患者多为免疫力低下或有缺陷者，多合并基础疾病，包括2型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、慢性肾功能不全、心功能不全、晚期肿瘤接受放化疗，或者曾多次住院接受多种、多类广谱抗生素抗感染治疗以及接受糖皮质激素治疗患者。入选病例主要以发热，咳嗽、咳痰、胸闷、气短为主要临床表现，常规抗感染治疗效果不佳，胸部影像学以支气管囊柱状扩张，空洞形成，晕轮征、新月体征为主要表现;多有发热、咳痰、气短症状，普通感染治疗后症状无好转，甚至加重，胸部影像学为肺部结节、空洞及晕症等表现。排除标准：不能耐受气管镜检查或近期有大咯血、合并严重心脑血管疾病、恶性心律失常等气管镜检查禁忌证患者。

1.2 仪器和试剂：沙保弱式培养基(郑州人福博赛生物技术有限公司)；酶标仪(Tecan公司)Bio-rad 洗板机(美国伯乐)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔)；旋涡混合器(其林贝尔VORTEX-5)；生化培养箱(广东省医疗器械厂)；SSW-600-2S 型电热恒温水槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；曲霉菌抗原检测试剂盒(酶联免疫法，96 人份/盒，伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.3 IPA诊断标准：IPA诊断标准根据我国制定的《肺真菌病诊断和治疗专家共识》[4]及《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则》[5]等有关标准，同时根据宿主因素、临床症状、病原学检查结果3个标准对IPA诊断进行综合判断。

1.4 样本收集

1.4.1 肺泡灌洗液收集：按照电子支气管镜操作流程对患者进行术前雾化麻醉，测量生命体征。术前准备完毕后患者取平卧位，气管镜自鼻孔通过声门到达主支气管，然后对各叶段支气管进行常规检查、拍照。随后电子支气管镜顶端置入病变所在的亚段支气管，经活检孔分2～3次注入常温生理盐水，每次用量约为20 mL，用负压吸引器迅速回收灌洗液，尽量回收充分，将回收液装入硅塑瓶保存备用。

1.4.2 血液标本采集：在气管镜检查当日清晨按照标准操作规程采集非抗凝血3 mL，放入4 ℃冰箱保存等待检测。

1.5 样本GM实验检测原理：血清标本与BALF标本检测方法相同，实验采用ELISA方法，使用特异性抗体检测曲霉半乳甘露聚糖抗原。先将预处理过的待检测血清或BALF标本与抗半乳甘露聚糖抗体分别加入包被有曲霉菌半乳甘露聚糖酶的微板小孔里，经育温和洗板后加入酶标抗体，再次冲洗除去没有结合的物质，加显色液发生显示反应，用酶标仪测定吸光度。每次检测均设阴性对照、阳性对照、临界值对照以验证实验结果的有效性。样本要求与检测方法严格按照试剂说明书进行操作，BALF和血清GM试验以待测标本的指数I≥0.5为诊断界值。

1.6 真菌培养与结果鉴定：用无菌接种针蘸取BALF 10 μL，接种于琼脂培养基中，放置在37 ℃温箱中培养。 分别在接种24、48和72 h后对培养基上菌落的生长颜色与形态进行观察，初步判断是否为曲霉菌。然后取少量沙保罗平皿上疑似曲霉菌放置在洁净的玻片上，经棉蓝染色后镜检观察，若是镜下发现分隔的，呈45°角分支的菌丝即可以判定为曲霉菌培养阳性。

1.7 统计学方法：采用SPSS 22.0统计软件，按照厂家推荐标准，BALF和血清GM试验以待测标本的指数I≥0.5 为诊断界值。 采用χ2检验分析GM试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的差异，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺泡灌洗液(BALF)真菌培养结果及GM实验I值分布情况：374例入选病例中，共培养出真菌患者226例，其中曲霉菌阳性患者103例，念珠菌阳性患者123例；148例培养结果阴性。与相同I值的曲霉菌阳性组病例数量比较，念珠菌阳性组与培养阴性组比较差异有统计学意义(P<0.05)。曲霉菌阳性患者中，75例(72.82%)GM实验I值结果大于2，I值小于0.5患者2例(1.94%)，0.5～1为6例(5.83%)，1～1.5为8例(7.77%)，1.5～2为12例(11.65%)，平均I值结果为(3.54±1.06)；念珠菌阳性组与培养阴性组GM实验I值结果均小于0.5，所占比例分别为74例(60.16%)与120例(77.70%)，2组与相同I值的曲霉菌阳性组进行比较差异具有统计学意义(P<0.05)，其中I>2时差别最为明显，见表1。

表1 肺泡灌洗液(BALF)真菌培养结果及GM实验I值分布情况

2.2 肺泡灌洗液(BALF)GM实验检测I值与肺曲霉菌病(IPA)诊断符合率:在所有入选病例中共有103例曲霉菌培养结果阳性，在判断肺泡灌洗液GM实验结果I值与IPA诊断符合率时，如果将临界值设定为0.5，诊断敏感性为98.60%，特异性为74.50%，阳性预测值55.19%，阴性预测值98.95%；如果将临界值设定为1.0，诊断敏感性为92.30%，特异性为84.10%，阳性预测值67.86%，阴性预测值96.58%；将临界值设定为1.5，诊断敏感性为84.50%，特异性为92.60%，阳性预测值79.82%，阴性预测值93.96%；如果将临界值设定为2.0，诊断敏感性为71.80%，特异性为96.70%，阳性预测值89.29%，阴性预测值90.34%。见图1(目录后)，当GM实验值为1.369 ng/mL时，ROC曲线下面积最大为0.954，此时敏感性为89.30%，特异度为91.10%，将GM值设定为1.369 ng/mL为最佳阈值。

2.3 肺泡灌洗液(BALF)真菌培养结果与血清GM实验I值分布情况:103例经肺泡灌洗液真菌培养确诊的肺曲霉菌病患者中，在行灌洗液GM实验检测的同时，也接受了血清GM实验检测，其中47例(45.63%)患者实验结果I值小于0.5；23例(22.33%)I值在0.5～1,18例(17.48%)在1～1.5，9例(8.74%)在1.5～2，6例(5.83%)I值大于2。念珠菌阳性组与培养阴性组患者肺泡灌洗液GM实验I值均以小于0.5为主，所占比例分别为84例(68.29%)，124例(83.78%),见表3。

表3 肺泡灌洗液(BALF)真菌培养结果与血清GM实验I值分布情况

2.4 血清GM实验检测不同临界值I与IPA诊断符合率:在判断血清GM实验结果I值与IPA诊断符合率时，如果将临界值设定为0.5，诊断敏感性为54.30%，特异性为77.10%，阳性预测值47.10%，阴性预测值81.60%；如果将临界值设定为1.0，诊断敏感性为32.00%，特异性为87.10%，阳性预测值56.90%，阴性预测值77.80%；如果将临界值设定为1.5，诊断敏感性为14.60%，特异性为94.50%，阳性预测值51.70%，阴性预测值94.50%；如果将临界值设定为2.0，诊断敏感性为5.80%，特异性为98.50%，阳性预测值60.00%,阴性预测值为73.40%。见图2(目录后)，当血清GM实验值为0.512 ng/mL时，ROC曲线下面积最大为0.649，此时敏感性为54.40%，特异度为77.10%，将血清GM实验阈值设定为0.512 ng/mL为最佳阈值。

3 讨论

侵袭性肺曲霉菌病(IPA)是曲霉菌侵犯肺组织后引起的深部真菌感染性疾病，为侵袭性肺真菌感染(IPFI)的一种，该病以发展成坏死性出血性肺炎，形成多发性肺脓肿或肉芽肿为特征，病情进展迅速，临床症状凶险，常因漏诊、误诊致使患者未得到及时治疗从而使死亡率有所上升[6]。目前该病诊断的金标准是组织病理学，但是临床上因病灶部位、患者特征、主观意愿等因素存在取材困难，阴性结果无法有效排除曲霉菌肺炎等问题，临床普遍开展存在困难。病原学检查是诊断肺曲霉病重要的基础方法，经痰或血液培养出曲霉菌可以作为确诊标准之一[7]。但传统的实验室培养，存在耗时长、阳性率低、敏感性差等缺点，在一定程度上限制了临床上对IPA的早期诊断。目前G试验与GM试验等真菌抗原检测技术已经在临床中广泛应用。曲霉菌肺炎的早期病变局限在肺部，相关抗原暂未释放入血或者少量释放入血，容易导致血清GM试验出现假阴性结果，同时血清GM实验，容易受如输注血液制品，进行血液透析，使用抗肿瘤、磺胺类抗生素等药物，使用半合成青霉素等各种因素影响而出现假阳性或者假阴性结果，不利于IPA的早期诊断[8-10]。在BALF中，存在大量的吞噬细菌，能将真菌吞噬后释放较多的半乳甘露聚糖，半乳甘露聚糖广泛分布于曲霉菌细胞壁中，当这些成分进入人体血液或深部组织，被吞噬细胞吞噬消化后，半乳甘露聚糖从细胞壁中释出[11-13]。 因此，BALF标本GM试验检测可以成为IPA辅助诊断的重要手段之一，但是目前国内外尚无公认的BALF样本GM实验对于IPA的诊断阈值，致使临床医师对该病的诊断率也参差不齐。为此，本研究通过分析374例BALF及血清的GM试验结果，根据真菌培养结果进行比较和分析，为BALF样本GM试验在诊断IPA时I值的临界值设定提供参考。

本研究共纳入患者374例，对所有患者BALF标本进行培养后，共培养出真菌感染患者226例，其中曲霉菌阳性患者103例。不同培养结果组BALF标本的GM结果具有明显统计学差异，说明BALF标本GM实验可以对IPA诊断判定提供有效依据。从表2我们可以看出，按全国临床检验操作规程[14]，如果将诊断阈值设定为0.5，有82例假阳性患者，特异度为69.74%。根据IPA诊治指南推荐，IPA的抗真菌疗程一般为6～12周，加之抗真菌治疗药物价格昂贵，如将诊断阈值设定为0.5，会明显增加误诊率，从而增加患者经济负担以及抗真菌治疗药物可能出现的患者肝肾功能损伤概率。为此，本研究进一步分析了肺泡灌洗液GM实验检测I值与肺曲霉菌病诊断符合率的关系，当把临界值分别设定为0.5、1.0、1.5、2.0时敏感性、阴性预测值逐步下降，但是特异性、阳性预测值逐渐增高。根据图1的ROC曲线我们可以看出，当把肺泡灌洗液GM阈值设定为1.369 ng/mL时，此时AUC最大为0.954，诊断意义最佳。此结论与Zhang XB[15]等人建议的将BALF阈值设定为1.0不符。在本研究统计的BALF标本中，有些病例真菌培养为阴性，但是GM 试验结果明显升高，表现为假阳性，可能原因为BALF在收集过程中与外界相通，呈非密闭性，产生了一些病原体污染样本，或某些外抗原与GM 试验发生交叉反应导致GM 实验呈现假阳性[16]。

按照GM实验试剂盒推荐阈值0.5统计，103例BALF培养阳性患者中，有56例(54.37%)患者血液GM实验结果符合，而有47例(45.63%)患者为假阴性，明显低于肺泡灌洗液101例(98.06%)的阳性率。根据血清GM实验诊断侵袭性肺曲霉菌病的ROC曲线我们可以看出，当GM阈值设定为0.512 ng/mL时诊断意义最佳。但是与肺泡灌洗液GM实验诊断曲霉菌肺炎的ROC曲线相比，其敏感性、特异性均明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，这与国内外众多相关研究结论[17-18]相符合。

综上所述，在IPA诊断过程中，肺泡灌洗液GM试验诊断侵袭性肺曲霉菌感染更具有准确性。我们可以将BALF的GM实验诊断阈值设定为1.369 ng/mL。对于不能耐受气管镜的患者，可以通过血清GM实验辅助诊断，这些患者将I值设定为0.512 ng/mL比较合理。