人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的制备工艺1)

柴艳敏 陈宁 张紫微 周婉梅 郑威

(哈尔滨商业大学，哈尔滨，150076)

人参是名贵药材，主要含有人参皂苷、人参多糖等活性成分，广泛用于多种疾病的治疗[1]。人参皂苷Rg1属四环三萜类皂苷，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力、保护心血管系统和神经系统等多种药理作用[2-7]。人参皂苷Rg1应用的研究，较多集中于改善认知功能障碍、学习记忆能力、抑制阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积方面的研究。由于人参皂苷Rg1具有多靶点、毒性低等优势，可以降低活性氧(ROS)的过多积累，保护神经元，能有效抑制乙酰胆碱水解酶(AchE)活性的能力，进而减少β-淀粉样蛋白的产生，提高阿尔茨海默症(AD)小鼠学习与记忆的能力，发挥抗阿尔茨海默症的作用[8-10]。人参皂苷Rg1是一种包含亲脂性类固醇骨架和亲水性糖环的固醇类化合物，水溶性欠佳、亲水性糖环易发生水解、稳定性差，影响了其治疗效果。但是，关于人参皂苷Rg1水溶性的纳米颗粒制备的研究较少。

羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)属环糊精衍生物，内部筒状空腔结构，具有水溶性好、安全性高等特点，是优选的包合壁材，作为药物辅料在药剂学方面已经有广泛的应用[11]。为此，本研究以人参皂苷Rg1为原料、羟丙基-β-环糊精为载体、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径为评价指标，通过单因素试验、正交试验优化制备工艺，制备人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒；应用红外光谱、扫描电镜、X射线衍射、热质量分析、体外缓释试验，对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒进行表征；旨在为人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒制备工艺参数的优选提供技术参考。

1 材料与方法

材料：人参皂苷Rg1标准品、人参皂苷Rg1(质量分数>90%)、羟丙基-β-环糊精(质量分数>98%)，由上海源叶生物科技有限公司购入；超纯水、无水乙醇。

仪器与设备：紫外-可见光分光光度计UV-2600(岛津仪器有限公司)、ZetaPALS激光粒度仪(美国布鲁克海文仪器公司)、IRAffinity-1傅里叶变换红外色谱(FTIR，日本岛津公司)、1525高效液相色谱仪(HPLC，WATERS)、NETZ5CH热质量分析仪(德国耐驰)。

人参皂苷Rg1纳米颗粒制备方法：参照文献[12]精密称取一定量羟丙基-β-环糊精，加入一定体积的超纯水，60 ℃溶解后冷却至所需温度；另取一定质量的人参皂苷Rg1，用适量的无水乙醇溶解，超声后用有机滤膜过滤，将人参皂苷Rg1乙醇溶液缓慢滴加到羟丙基-β-环糊精溶液中，恒温下磁力搅拌一定时间，负压旋蒸除去乙醇，冷冻干燥，制得人参皂苷Rg1纳米颗粒，室温保存备用。

单因素试验设计：以人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的粒径为评价指标，分析m(人参皂苷Rg1)∶V(水)、m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)、反应温度、反应时间、搅拌速度对粒径的影响。

正交试验设计[11]：在单因素试验基础上，以人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的粒径为评价指标，采用正交试验设计(L9(34))对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒制备工艺进行优化；各工艺参数设计3个梯度(见表1)，每组进行3次平行试验。

表1 人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒制备工艺参数遴选的梯度设计

人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒样品中人参皂苷Rg1质量分数测定：借鉴文献[13]～[15]，将标准储备液(1 g·L-1)稀释成不同的质量浓度，采用1525高效液相色谱仪检测，检测波长为203 nm；色谱柱为C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、流动相为V(乙腈)∶V(水)=1∶4、流速为1 mL·min-1、柱温30 ℃、进样量10 μL、保留时间36 min。人参皂苷Rg1回归方程为Y=3×106x-112 555(R2=0.999 7，n=8)，式中的Y为峰面积，x为人参皂苷Rg1质量浓度。通过人参皂苷Rg1标准品的标准曲线及保留时间，计算出人参皂苷Rg1在人参皂苷Rg1颗粒中的质量分数。

羟丙基-β-环糊精对人参皂苷Rg1包合效果检测方法：应用红外光谱、X射线衍射分析法进行羟丙基-β-环糊精对人参皂苷Rg1包合效果检测。红外光谱检测的扫描波长范围为400～4 000 cm-1，分别称取200 mg溴化钾样品、2.0 mg人参皂苷Rg1、2.0 mg羟丙基-β-环糊精、2.0 mg人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒，混匀研磨压片进行检测，以溴化钾作空白对照。在检测范围5°～90°、速度5°·min-1，将这3种样品放到具有转动探头的X射线衍射仪上(飞利浦，荷兰)，进行分析。

人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒热稳定性分析方法：应用热质量分析方法分析人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒热稳定性。分别称取20～25 mg人参皂苷Rg1、羟丙基-β-环糊精、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒放在氧化铝坩埚，氮气气氛，加热温度从40～800 ℃，升温速率为10 ℃·min-1；以空坩埚作为基线，对3种样品的热分解规律进行检测。

3种样品的表面形态观察方法：将人参皂苷Rg1、羟丙基-β-环糊精、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒真空镀金后，通过电子显微镜(MX2600FE，Camscan，UK)扫描，观察3种样品的表面形态特征。

人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒体外释放量检测方法：借鉴文献[16]，以浓度为0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲盐溶液为溶出介质，将人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒样品分别放置在透析袋中，分别在设定的时间取样，通过紫外光光度计对样品溶液中人参皂苷Rg1释放量进行检测分析。

2 结果与分析

2.1 各因素对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响

m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响：当其他因素固定(m(人参皂苷Rg1)∶V(水)为1 g∶20 mL、反应温度25 ℃、反应时间45 min、搅拌速度1 200 r·min-1)，不同m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)时(1 g∶1 g、2 g∶1 g、3 g∶1 g、4 g∶1 g、5 g∶1 g)，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径分别为(1 019±37)、(622±25)、(496±23)、(401±21)、(406±22)nm；随着羟丙基-β-环糊精用量的增大，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径呈现先急剧降低，而当羟丙基-β-环糊精用量比超过4 g∶1 g时，趋于平缓。因此，选择m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g。

m(人参皂苷Rg1)∶V(水)对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响：当其他因素固定(m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g、反应温度25 ℃、反应时间45 min、搅拌速度1 200 r·min-1)，不同m(人参皂苷Rg1)∶V(水)时(1 g∶5 mL、1 g∶10 mL、1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL)，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径分别为(867±34)、(582±23)、(399±21)、(376±22)、(385±20)nm。随着m(人参皂苷Rg1)∶V(水)的增大，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径呈现趋势为先急剧降低后趋于平缓；当m(人参皂苷Rg1)∶V(水)高于1 g∶20 mL时，降低幅度不大，过大的m(人参皂苷Rg1)∶V(水)会使后续处理的能耗增加。因此，m(人参皂苷Rg1)∶V(水)确定为1 g∶20 mL。

反应温度对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响：当其他因素固定(m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g、m(人参皂苷Rg1)∶V(水)为1 g∶20 mL、反应时间45 min、搅拌速度1 200 r·min-1)，不同反应温度时(25、40、55、70、85 ℃)，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径分别为(365±20)、(376±23)、(391±21)、(382±22)、(362±21)nm。当反应温度在25～55 ℃时，随着温度升高，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径呈现逐渐增加的趋势，这主要是因为温度较高使其团聚；当反应温度高于55 ℃时，随着温度的升高，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径呈现逐渐降低的趋势，这主要是因为高温使乙醇挥发，有利于其形成；但低温条件更有利于制备，因此，反应温度设置为25 ℃。

反应时间对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响：当其他因素固定(m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g、m(人参皂苷Rg1)∶V(水)为1 g∶20 mL、反应温度25 ℃、搅拌速度1 200 r·min-1)，不同反应时间时(15、30、45、60、90 min)，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径分别为(454±21)、(416±20)、(387±22)、(643±25)、(829±31)nm。人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径呈现先逐渐降低、后增加的趋势，这主要是因为随着反应时间延长而使人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒团聚。因此，反应时间选定为45 min。

搅拌速度对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响：当其他因素固定(m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g、m(人参皂苷Rg1)∶V(水)为1 g∶20 mL、反应温度25 ℃、反应时间45 min)，不同搅拌速度时(400、800、1 200、1 600、2 000 r·min-1)，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径分别为(1 724±39)、(826±33)、(397±22)、(406±21)、(421±22)nm。随着搅拌速度的增加，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径呈现先急剧降低、后缓慢增加的趋势。这主要是因为充分的搅拌有利于纳米颗粒子形成和分散，当搅拌速度过高时，人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒团聚作用增加。因此，最优搅拌速度为1 200 r·min-1。

2.2 人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒制备工艺参数遴选

本研究按照三因素三水平设计正交试验，遴选人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒制备工艺参数。按照试验方案(L9(34))，9组试验结果的人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径分别为(786±24)、(516±27)、(559±29)、(492±22)、(441±23)、(460±26)、(588±31)、(472±32)、(410±28)nm；对试验结果进行极差分析(见表2)、方差分析(见表3)。由表2、表3可见：3个因素对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒粒径的影响，由大到小依次为m(人参皂苷Rg1)∶V(水)(因素A)、m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)(因素B)、反应时间(因素C)；人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒最佳制备工艺为A2B2C2(m(人参皂苷Rg1)∶V(水)为1 g∶20 mL，m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g，反应时间为45 min)。在此条件下，3次平行验证试验获得平均粒径为(405±20)nm、人参皂苷Rg1平均包合率为(87.95±3.41)%。

表2 正交试验结果的各因素不同梯度的均值及极差

表3 正交试验中各因素对试验结果影响的显著性

2.3 人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒性能

由图1可见：人参皂苷Rg1原料为淡黄色块状粉末，而人参皂苷Rg1水溶性纳米粉为均匀乳白色粉末。由扫描电子显微镜扫描结果(见图C)可见，人参皂苷Rg1水溶性纳米粉呈不规则簇状，表面形态为结构松散的短棒状纳米颗粒，颗粒之间缝隙明显，说明其具有较大的比表面积，水溶解性能得到较明显提高。

A为人参皂苷Rg1原料照片；B为人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒照片；C为人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的扫描电子显微镜扫描图。

人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的热稳定性：物质热解过程通常分为3个阶段[17]，差热质量分析法曲线的峰值表示该温度下样品的最大质量损失。人参皂苷Rg1原料、羟丙基-β-环糊精、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒热质量分析表明：在200～220 ℃处，人参皂苷Rg1有明显的低相对分子质量组分热解峰，并且在300～390 ℃处还有较宽的高相对分子质量组分热解峰；而羟丙基-β-环糊精，在350 ℃附近只有1个明显的高相对分子质量组分热解峰；人参皂苷Rg1水溶性纳米粉，不仅在230 ℃附近有低相对分子质量组分热解峰，在345 ℃附近还有1个明显的高相对分子质量组分热解峰；说明人参皂苷Rg1和羟丙基-β-环糊精，可以通过实验方法很好地形成人参皂苷Rg1水溶性纳米粉。

羟丙基-β-环糊精对人参皂苷Rg1的包合效果：①经人参皂苷Rg1水溶性纳米粉、原料及羟丙基-β-环糊精红外谱图分析，在3 266 cm-1处人参皂苷Rg1有较强的羟基伸缩振动吸收峰，羟丙基-β-环糊精也有此现象，而人参皂苷Rg1水溶性纳米粉的羟基伸缩振动吸收峰则明显减弱；这表明人参皂苷Rg1和羟丙基-β-环糊精之间，通过氢键缔合反应，形成稳定的人参皂苷Rg1水溶性纳米粉。在2 982、2 853 cm-1处为甲基和亚甲基振动吸收峰；在1 692 cm-1处为羰基(—CO)伸缩振动峰；此外，位于935 cm-1处吸收峰，代表双键上的—CH平面外变形振动。人参皂苷Rg1水溶性纳米粉的谱图和羟丙基-β-环糊精的吸收光谱相似，也说明羟丙基-β-环糊精对人参皂苷Rg1形成了很好的纳米包合作用。②羟丙基-β-环糊精、人参皂苷Rg1原料、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的X射线衍射实验结果表明，羟丙基-β-环糊精和人参皂苷Rg1水溶性纳米粉有2个相似的X射线衍射峰，分别在衍射角11°、18°有衍射峰出现。人参皂苷Rg1水溶性纳米粉的峰型，没有羟丙基-β-环糊精的峰型尖锐，其中人参皂苷Rg1的特征峰消失，而人参皂苷Rg1在衍射角17°左右有尖锐的衍射峰。这些都说明，羟丙基-β-环糊精对人参皂苷Rg1进行了很好的包合，形成结构均一的人参皂苷Rg1水溶性纳米粉。

人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒体外溶出性能：依据2020年版《中国药典》测定溶出度。称取一定质量的人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒、人参皂苷Rg1，以pH为6.8的磷酸盐缓冲液为溶媒，配置释放溶液体系，溶液温度控制在(37.0±0.5)℃范围，转速为100 r·min-1，按照预定时间分别吸取这两种样品溶液5.0 mL，并补充等体积新鲜的磷酸盐缓冲液到溶液体系，以便保持溶液总体积不变。用0.45 μm微孔滤膜滤过后，参照高效液相色谱法测定峰面积，计算人参皂苷Rg1溶出度(见表4)。由表4可见：人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒、人参皂苷Rg1在溶解25 min时的溶出率，分别达到了90.88%、58.42%，具有显著差异性；表明人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的溶出更迅速、水溶性更好、生物活性更佳。

表4 人参皂苷Rg1水溶性纳米粉和人参皂苷Rg1原料体外溶出时效

3 结论

本研究以人参皂苷Rg1为原料、羟丙基-β-环糊精为载体、人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒的粒径为评价指标，通过单因素试验、正交试验对人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒制备工艺进行优化，并获得最优制备工艺(m(人参皂苷Rg1)∶V(水)为1 g∶20 mL、m(羟丙基-β-环糊精)∶m(人参皂苷Rg1)为4 g∶1 g、反应温度为25 ℃、反应时间为45 min)。通过验证试验获得平均粒径为(405±20)nm的人参皂苷Rg1水溶性纳米颗粒，具有良好的水溶性和体外释放能力。本研究为难溶性的人参皂苷开发和利用提供了基础数据和技术支撑，将为一些退行性神经疾病治疗药物的开发提供参考，也为人参皂苷Rg1广泛的应用前景提供支持。