黑皮油松挥发物季节变化规律1)

崔磊 李鸿 雷玲

(吉林农业大学，长春，130118)(吉林科技职业技术学院)

黑皮油松(Pinustabuliformis)是松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物，是东北地区主要的常绿树种，其针叶释放出的挥发物(VOCs)具有较强的抑菌能力[1]，可有效抑制空气中细菌的数量并阻止其传播。关于黑皮油松松针抑菌方面的研究主要集中在提取抑菌物质的技术优化，王得道[2]、张云奕等[3]利用水蒸馏蒸汽法提取黑皮油松松针精油；李怡铮等[4]、包怡红等[5]采用超声波提取技术优化黑皮油松松针黄酮成分的提取，并测定黑皮油松松针精油的抑菌效果及稳定性，对食品的保鲜、防腐及利用具有重要意义。但关于黑皮油松针叶挥发性物质在森林与城市生态效益方面的研究相对较少，段辉等[6]在研究甘肃地区的油松林不同季节针叶挥发物的相对百分比变化发现，油松冠层、郁闭度、枝位对挥发物相对百分比有显著影响。本研究主要探究城市中黑皮油松针叶挥发物随季节、生境等因素的动态变化规律，为黑皮油松在城市环境中更好的发挥生态效益提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

以长春市吉林农业大学校园(农大校园)、校园缓冲带(新城大街农大路段)、校园后山林地(农大林地)中的黑皮油松为调查对象，以冬季(2018年12月20日)、春季(2019年5月20日)、夏季(2019年7月22日)、秋季(2019年10月12日)上午09:00—10:00为采样时间[7]，选择黑皮油松胸径相似((10.0±0.5)cm)的3个样地为采样地点并计算不同样地黑皮油松植物群落多样性[8]的主要指标(表1)。各样地选取5株黑皮油松，从上、中、下3个冠层，东、南、西、北4个方位采集1年生枝的顶部及中部针叶，每株树采集针叶约100 g，清洗表面，混合均匀剪成0.5～1.0 cm，备用。

表1 黑皮油松生长状况与植物群落多样性

1.2 室内水枝插法抑菌试验

各季节晴朗天气时，采集3个样地中黑皮油松1年生枝条，采集时注意采集植物不同方位及高度的针叶约200 g，采集后迅速装入自封袋中带回实验室，用无菌水洗净，冰箱4 ℃保存。采用室内水插枝法，将各样地针叶样品用体积分数4%的次氯酸钠水溶液浸泡5 min，再用无菌水快速冲洗，然后将针叶放入消毒过的自封袋，在烘箱中30 ℃烘20 min，将针叶快速取出自封袋再加入100 mL无菌水快速放入标准框(1 m×1 m×1 m)中，保鲜膜密封24 h。对照组仅加入100 mL无菌水。24 h后，将3个盛有牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿快速放入标准框中，30 min后取出。将培养基放入37 ℃恒温培养箱中24 h，计算菌落数，结合公式算出抑菌率[9]。

1.3 松针挥发物提取

采用水蒸气蒸馏法[5]，称取剪好的1年生黑皮油松针叶100 g，放入1 000 mL烧杯中，添加5%盐酸配制的酸水至1 000 mL。用超声波清洗器处理1 h后，加入5 g纤维素酶并搅拌5 min，保鲜膜密封静置3 h，再加入4 g NaCl，用多套500 mL提取器同时进行挥发物提取。待溶液沸腾后，在微沸状态保持4.5 h。将蒸馏出的挥发物，用无水硫酸钠干燥，放入棕色瓶在4 ℃条件下密封保存，再利用挥发物提取率公式[5]算出不同样地黑皮油松针叶的挥发物提取率。

1.4 黑皮油松挥发物成分鉴定

黑皮油松针叶挥发物成分鉴定在6890N-5975C GC-MS(安捷伦，美国)上进行，色谱柱为HP-5(30 m×250 μm×0.25 μm)。程序升温：初始温度为60 ℃，保持3 min后，以10 ℃·min-1上升到280 ℃，保持15 min，共计用时40 min；进样器为不分流进样；进样口温度280 ℃；载气(高纯He)；载气流量1.0 mL·min-1；分流比50∶1；进样量为1 μL。质量扫描范围质荷比(m/z)为50～550 u；电子倍增器电压1 964.7 V；电子轰击离子源(EI)70 eV，离子源温度230 ℃；传输线温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃。运用NIST-2002质谱数据库进行自动检索、解析，确认其化学成分，并在计算机检索的基础上进行人工识别和判读[10]。

1.5 数据处理

采用SPSS 20.0统计分析软件及Excel 2007对不同样地的黑皮油松针叶挥发物相对百分比进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同样地黑皮油松抑菌率比较

由表2可知，在不同季节，黑皮油松在农大林地中的抑菌率较高，冬季的平均抑菌率较低，为(40.1±3.4)%，夏季平均抑菌率最高，为(73.4±7.6)%。而农大校园、新城大街农大路段在冬季的抑菌率较低，平均抑菌率分别为(-40.0±5.2)%、(-28.6±3.9)%，均低于对照处理。在春季与秋季，农大校园的抑菌率明显高于新城大街农大路段的抑菌率，新城大街农大路段黑皮油松的平均抑菌率为12.0%～14.3%。夏季，黑皮油松在农大校园与新城大街农大路段的抑菌率差异不明显，平均抑菌率均在25.0%左右。

表2 不同季节3样地黑皮油松抑菌率

2.2 黑皮油松挥发物成分提取对比

由冬季至翌年秋季，不同样地黑皮油松挥发物随季节变化呈现的变化趋势不同(表3)。农大校园自冬季至翌年夏季，黑皮油松的挥发物提取率较平稳，提取率在0.20%左右，秋季的挥发物提取率上升，接近0.30%。新城大街农大路段在冬、春2季挥发物提取率较高，挥发物提取率分别为(0.350±0.058)%、(0.551±0.037)%。

表3 不同季节3样地黑皮油松挥发物提取率对比

2.3 黑皮油松挥发物提取率与影响因子分析

黑皮油松挥发物提取率与抑菌率、光照强度、湿度、风速、郁闭度等因素具有不同程度的相关性。由表4可知，夏季黑皮油松挥发物提取率与抑菌率呈极显著正相关，说明黑皮油松在夏季的光合作用与蒸腾作用强，黑皮油松挥发物合成速率与释放量均较高。冬季影响黑皮油松挥发物提取率的主要因子为湿度、Simpon指数、Shannon-wiener指数。春季黑皮油松挥发物提取率与光照强度呈显著正相关，与风速呈极显著负相关。夏季由于温度高，光照较强，黑皮油松针叶为减少水分的蒸腾作用，导致挥发物提取率与郁闭度、枝下高均呈极显著正相关。夏季，挥发物提取率与Simpson指数、Shannon-Wiener指数、冠幅呈极显著负相关，原因是夏季植物种类丰富，物种之间相互竞争营养与水分，导致黑皮油松针叶的挥发物提取率减少。秋季温度降低，光照减弱，植物群落中的其他阔叶植物处于半休眠或休眠状态，与黑皮油松竞争营养和光照的植物种类减少，使黑皮油松针叶中的挥发物积累较多，因此，黑皮油松挥发物提取率与Simpson指数、Shannon-Wiener指数、冠幅呈极显著正相关。

表4 黑皮油松挥发物提取率与环境因子的相关性

2.4 黑皮油松挥发物成分组成及动态变化

由于农大林地中黑皮油松的抑菌率较高，黑皮油松挥发物提取率较稳定，本研究通过检测农大林地中黑皮油松1年生枝针叶中的黑皮油松挥发物成分，其中冬季、春季、夏季、秋季总离子流图见图1、图2、图3、图4，黑皮油松挥发物的主要成分及相对百分比见表5。黑皮油松针叶中的挥发物有121种，其中黑皮油松挥发物中检测到相对百分比超过0.10%的有机物，共计34种。冬、春季节黑皮油松挥发物中相对百分比超过0.10%的有机物分别占总量的73.69%、73.22%，夏、秋季节则分别占89.79%、84.40%。

表5 各季节黑皮油松挥发物主要成分

图1 冬季黑皮油松挥发物总离子流图

图2 春季黑皮油松挥发物总离子流图

图3 夏季黑皮油松挥发物总离子流图

图4 秋季黑皮油松挥发物总离子流图

各季节黑皮油松挥发物以萜烯类物质为主，醇类与有机酸类较多。冬季，黑皮油松挥发物中萜烯类化合物相对百分比占总量的51.70%，主要为γ-衣兰油烯(9.43%)、β-石竹烯(7.38%)、α-蒎烯(4.18%)等；酯类占13.67%，主要为乙酸龙脑酯(8.61%)。春季，黑皮油松挥发物中萜烯类化合物百分比占总量的51.95%，其中，β-石竹烯(13.28%)、α-蒎烯(5.88%)百分比升高，β-蒎烯百分比达12.74%，其他有机物质百分比较少。进入夏季，黑皮油松挥发物中β-石竹烯(14.37%)百分比继续升高，α-蒎烯(7.03%)、β-蒎烯(9.88%)、d-柠檬烯(6.90%)、γ-松油烯(6.43%)百分比均较高，石竹素为各季节最低，为1.45%，有机酸(7.52%)、醇类(15.17%)较低，其中α-松油醇为4.22%，相对较高。入秋后，黑皮油松挥发物中β-石竹烯(14.60%)、α-蒎烯(8.48%)百分比持续升高，γ-衣兰油烯(6.03%)比春、夏季节升高明显，酯类百分比升高，为13.34%，其中乙酸龙脑酯百分比较冬季高，为10.17%。不同季节黑皮油松挥发物中萜烯类物质的变化趋势由高到低依次为秋季、夏季、春季、冬季；醇类物质的季节变化趋势由高到低依次变化趋势为冬季、夏季、秋季、春季；酯类物质的季节变化趋势由高到低依次则为春季、秋季、冬季、夏季。

3 结论与讨论

自然沉降法是检测树木抑菌能力的传统方法，受环境影响较大，不能较好的反应某一种树木抑菌能力。因此，本研究对长春市不同生境黑皮油松抑菌率的比较采用室内水插枝法[9]，该方法能够有效的排除油松抑菌能力的外部影响。由表2可知，冬季在农大校园与新城大街农大路段黑皮油松的抑菌率低于对照，这是因为黑皮油松挥发物在这2个样地中低百分比的某些醇类或脂类会促进细菌生长。张丽平等[11]研究发现体积分数4%乙醇和有机酸促进木醋杆菌细菌纤维素的生成。柴瑞娟等[12]研究发现1.5 mg·L-1的水杨酸适宜大肠杆菌的生长。李洪远等[13]、郄光发等[14]发现，夏、秋季节是挥发物释放的2个主要季节，同时，不同植物挥发物的释放情况在春、夏、秋3季中的任何1个月都可能成为某种植物挥发物平均释放速率最高的1个时期。谢小洋[15]、Son et al.[16]研究表明，油松夏季总挥发物相对百分比最高，春季次之。本研究表明，夏季，农大林地的黑皮油松抑菌率较高，挥发物提取率较稳定，与谢小洋等[15]的研究结果相似。

相关研究表明，影响挥发物释放的环境因子主要分为生物因子(如植物的林龄、植物的发育状态、植物的遗传特性等)和非生物因子(光照、温度、湿度、风力等)，其对挥发物的释放、组分、相对百分比有明显的影响[14，17]。温度、光照是影响挥发物释放的2个主要影响因素[18-19]，较高的温度有利于与萜烯类化合物合成酶的活化，且萜烯类挥发性物质释放可以散失植物体内大量热量，同时，蒸腾作用也为萜烯类化合物扩散创造条件。李娟等[20]对侧柏研究表明，植物挥发性成分释放种类及相对百分比随温度、湿度、光照的提高，其挥发性成分的释放也会增多。Janson[21]对欧洲赤松(Pinussylvestris)研究表明，环境湿度增加可加快挥发物的释放，也会使树木释放的挥发物组分发生改变。本研究表明，冬季，黑皮油松挥发物提取率与湿度呈显著负相关，也说明挥发量与湿度呈正相关，与Janson[21]的研究结果相似。春季，黑皮油松的挥发物提取率与光照强度呈显著正相关。Owen et al.[22]研究表明，光照强度与多种植物的挥发物提取率之间在一定范围内呈正相关，说明郁闭度低的环境中，植物挥发物提取率较高。

不同季节黑皮油松1年生枝叶挥发物各主要成分均为酯类、萜烯类、醇类化合物，主要成分中萜烯类相对百分比最高，为46.0%～67.8%。张倩等[23]研究发现，油松在天津地区是释放萜烯类较高的树种，与本研究结果相似。本研究中，各季节黑皮油松挥发物中单萜烯百分比为10.45%～27.87%。郭阿君[24]研究表明，樟子松单萜烯类相对百分比季节变化趋势由大到小依次为秋季、春季、夏季，其中，春、秋2季单萜烯类占主导地位，夏季萜类化合物百分比降低。夏季针叶树种单萜烯百分比降低与树势有关，树势较弱的针叶树种单萜烯百分比下降，这是因为单萜烯易挥发到环境中，但树本身的生长势较弱，合成单萜烯物质的速率下降，而树势较好的树种在夏季合成单萜烯物质的速率明显高于挥发到环境的速率，从而形成夏季单萜烯百分比最高的趋势，与郑义等[25]的研究结果相似。而崔义等[26]检测到黑皮油松石竹烯百分比为36.88%，明显高于本研究结果，崔义等[26]采用的萃取溶剂是正己烷，而本研究采用水做为萃取溶剂，正己烷的萃取效率较高，由此可知萃取溶剂的选择对研究结果存在明显的影响。

通过不同样地黑皮油松针叶抑菌率可知，各季节农大林地中黑皮油松抑菌率明显高于其他样地的抑菌率，春、秋2季，新城大街农大路段的黑皮油松抑菌率较低，平均抑菌率分别为14.3%、12.0%。通过挥发性成分提取率可知，冬、春季节新城大街农大路段的黑皮油松挥发物提取率是其他2个样地挥发物提取率的2倍左右；夏、秋季节，各样地的黑皮油松挥发物提取率变化较小。

相关分析可知，夏季黑皮油松挥发物提取率与抑菌率呈极显著正相关，其他季节呈现不同程度的负相关。黑皮油松挥发物提取率在冬季的主要影响因子是湿度、Simpon指数、Shannon-wiener指数；春季的主要影响因子是光照强度、风速。夏季，黑皮油松挥发物提取率与郁闭度、枝下高呈极显著正相关，与Simpson指数、Shannon-Wiener指数、冠幅呈极显著负相关。秋季，黑皮油松挥发物提取率与郁闭度、枝下高呈极显著负相关，与Simpson指数、Shannon-Wiener指数、冠幅呈极显著正相关。

对农大林地中黑皮油松挥发物成分鉴定可知，各季节中挥发物组成成分为121种，主要包括萜烯类、酯类、少量醇类，主要成分中萜烯类相对百分比最高。各季节萜烯类百分比变化趋势由大到小依次为秋季(62.86%)、夏季(62.74%)、春季(51.95%)、冬季(51.70%)，其中单萜烯百分比季节变化趋势由大到小依次为夏季(34.21%)、秋季(24.31%)、春季(18.92%)、冬季(11.30%)。各季节β-石竹烯各季节相对百分比均较高，其中，春季、夏季、秋季β-石竹烯相对百分比最高；冬季挥发物相对百分比最高为γ-衣兰油烯，占9.43%。