母树年龄、采穗时期和抑制物质对纳塔栎生根的影响1)

卜晓婷 乔孝禄 徐晓华 徐志标 翟金庭 李淑娴

(南京林业大学，南京，210037)(六安市金安区林业发展中心)(盐城林蚕站)(盐城林场)(南京林业大学)

纳塔栎(Quercusnuttallii)为壳斗科栎属落叶乔木，原产于美国佛罗里达州西部至德克萨斯州东南部沿海平原低洼地。纳塔栎根深叶茂，树形优美，每年11月初叶片转红，呈亮红色或红棕色，挂叶期可至第2年1月份，极具观赏价值。纳塔栎耐寒、耐旱、耐水湿，具有较强的抗污染能力及环境适应能力，是优良的园林绿化树种[1]。其木材为白色或浅棕色，坚实沉重，纹理美观，是高档家具及装饰用材[2]，具有广阔的应用前景。

纳塔栎以种子繁殖为主，但其种子具有明显的休眠特性，这给播种育苗生产带来了一定困难。扦插繁殖具有保持母株优良特性、繁殖系数高、材料易得、操作简便等优点，被广泛应用于林业生产中[3]。但国内外目前对纳塔栎扦插繁殖的研究还不多，且扦插生根率普遍不高。刘博等[2]研究了基质、植物生长调节剂处理对纳塔栎嫩枝扦插的影响，结果表明，V(泥炭)∶V(珍珠岩)∶V(蛭石)=1∶1∶1的混合基质扦插效果最好，将插穗在质量浓度为500 mg·L-1的ABT6溶液中浸泡2 h，其生根率最高，达39.4%；陈晨等[4]同样对纳塔栎嫩枝扦插进行了研究，他们发现用质量分数为200 mg·kg-1的ABT溶液对插穗处理2 h后，扦插生根率为33.3%。但这些学者并未对纳塔栎扦插生根率低的原因进行研究。黄利斌等[5]认为造成栎类树种难生根的主要原因是插穗体内存在酚类、单宁等抑制物质。但同一科属不同树种中影响扦插的抑制物的种类不尽相同，因此纳塔栎插穗中抑制物质的种类还不清楚。本研究拟用吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、间苯三酚(THB)的混合激素处理纳塔栎插穗，三者的质量浓度分别为500、250、50 mg·L-1，以期研究不同母树年龄、不同采穗时期对纳塔栎生根的影响，同时探讨纳塔栎生根过程中内源抑制物质的种类及相对百分比的变化，旨在深入了解纳塔栎的扦插特性，为纳塔栎扦插育苗生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 扦插床的制备

试验地位于南京市溧水区白马镇南京林业大学白马教学科研基地的扦插池内。扦插池南北走向，规格为1.2 m×12 m，扦插池中间每隔1 m设置1个高度为30 cm的插喷。扦插池底层铺15 cm厚的珍珠岩，上层基质由V(泥炭)∶V(珍珠岩)=2∶1混合而成，厚约20 cm。在扦插池上方使用透明塑料薄膜搭建小拱棚进行保湿。于扦插前1周，用500倍多菌灵溶液浇透基质消毒杀菌。

1.2 插穗的剪制与处理

分别于2017年8月14日、9月14日、11月14日，从1年生母树(2017年春天播种)和苗龄为4年生的母树上剪取生长健壮、无病虫害的当年新抽嫩枝作插条，二者均为实生苗。将采集的插条剪成长度为10～12 cm的插穗，插穗上端平切，下端斜切，切口保持平滑无破裂。每根插穗保留2个叶片，每个叶片剪去1/2。每30根插穗为1捆，将插穗基部置于IBA、NAA、THB质量浓度分别为500、250、50 mg·L-1的混合溶液中浸泡1 h(预试验表明，采用该混合激素处理，1年生纳塔栎苗的扦插生根率达88.8%)，对照为清水处理相同时间，每个处理3次重复，每重复30根插穗。扦插株行距5 cm×7 cm，深度2～3 cm。扦插后，每7 d喷施1次500倍多菌灵溶液[6]。扦插池内温度过高时需在拱棚外浇水或搭遮阳网以降低棚内温度。

1.3 生根情况统计

于扦插50 d后统计各处理的愈伤率、生根率、一级根数、平均根长。愈伤率为各处理形成愈伤组织的插穗数占总插穗数的百分比；生根率为各处理生根的插穗数占总插穗数的百分比。

1.4 GC-MS法确定纳塔栎生根抑制物的种类

2017年8月14日以1年生纳塔栎实生苗为材料进行扦插，分别在生根的前期(8月14日)、中期(9月4日)、后期(9月24日)取样，采用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定插穗中内源抑制物的种类及其相对百分比(相对百分比为待测物质中某一物质的峰面积占总峰面积的比例)。

插穗抑制物的提取和分离：取插穗基部(下切口往上3 cm)韧皮部2 g，在研钵中加入液氮磨碎后，转入25 mL离心管中，再加入20 mL体积分数为99.6%甲醇溶液，在密闭条件下浸提24 h。然后将浸提液放入离心机中以8 000 r·min-1的速度离心30 min，取上清液。将上清液置于旋转蒸发仪(RE-3000)上进行浓缩蒸馏，最后将溶液定容至5 mL，备用。

插穗提取液GC-MS鉴定：采用GC-MS测定内源抑制物的种类及其相对百分比，仪器型号为岛津QP2010ultraGC-MS；气相色谱条件为Rtx-5MS毛细管柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，流速为1 mL·min-1；色谱条件为进样口温度250 ℃，分流比为20；升温程序为35 ℃保持3 min，以6 ℃·min-1涨至300 ℃保持30 min；离子源温度为220 ℃，接口温度为260 ℃；离子扫描范围为45～500，进样量为1 μL。由计算机控制的库存信号检查质谱图并与标准图库普图核对。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel软件以及SPSS17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 激素处理对不同年龄插穗生根的影响

由表1可知，用混合激素处理不同年龄苗木的插穗，处理组的愈伤率、生根率均高于对照清水处理组。其中，1年生材料处理组的愈伤率是对照组的2倍，生根率是对照组的8.6倍，平均一级根数也显著多于对照组，但二者的平均根长没有显著差异。从4年生母树上剪取的插穗，处理组的愈伤率是对照组的1.7倍；对照组插穗的生根率为0，而处理组的生根率远高于对照组。因此该激素处理方法对纳塔栎扦插生根具有明显的促进效果。

表1 不同处理对纳塔栎扦插生根的影响

从表中还可以看出，从1年生、4年生母树上剪取的插穗，对照组中二者的愈伤率无明显差异；处理组中，1年生材料的愈伤率比4年生母树显著增加11.6%。对照组4年生母树插穗的生根率为0，而1年生生母树插穗的生根率为10.3%，显著高于4年生母树；处理组1年生材料的生根率比4年生母树显著增加了25.9%。1年生母树插穗处理组的一级根数、平均根长均高于4年生母树插穗的。上述结果均说明，在相同的处理情况下，1年生材料的扦插效果好于4年生母树。

对处理方法及采穗母树年龄对生根指标的影响进行双因素分析，结果见表2。除母树年龄与处理方法的交互作用与一级根数之间存在显著性差异，其余指标与母树年龄、处理方法及其交互作用均存在极显著差异。对于生根率、一级根数2个指标，影响效果由大到小依次为处理方法、母树年龄、母树年龄×处理方法。由此可见，不同处理方法是影响纳塔栎扦插生根的重要因素。

表2 不同处理和母树年龄对插穗生根指标影响的双因素分析

2.2 不同采穗时期对插穗生根的影响

用IBA、NAA、THB混合溶液处理不同采穗时间的插穗，结果见表3。从1年生母树剪取的插穗，8、9月份扦插的愈伤率都在98.5%以上，生根率均在85.0%以上，且2个月份扦插的插穗愈伤率、生根率均无显著差异；但11月份扦插的插穗愈伤率显著下降至85.5%，生根率显著下降至20.2%。一级根数11月份最小，为2.5条。各月份扦插的插穗平均根长差异显著，8月份扦插的最长，为7.3 cm；11月份最小，为5.1 cm。从4年生母树剪取的插穗，11月份扦插，愈伤率达89.2%，比8、9月份扦插的插穗愈伤率(分别为87.2%、84.2%)稍高，但3个时期扦插的插穗愈伤率无显著差异。3个采穗时期扦插的插穗生根率有较大差异，8月份的生根率最高，达62.9%；9月份的生根率显著下降为50.3%；而11月份的则完全不能生根。8、9月份扦插的插穗一级根数、平均根长均无显著差异。上述结果表明，木质化程度对插穗生根有一定的影响，木质化程度越高，插穗越难生根。

表3的结果再次说明，母树年龄对扦插生根有一定影响。8月份扦插时，从1年生母树剪取的插穗，其愈伤率(98.8%)比4年生母树(87.2%)高出12.6%；1年生材料的生根率为88.8%，显著高于4年生母树的生根率(62.9%)；同时，4年生母树的插穗，其一级根数、平均根长这2个指标也均较1年生材料的相应指标要低。9月份采穗时，1年生母树插穗与4年生的各项指标均表现出与8月份相同的变化规律。11月份采穗时，1年生、4年生母树插穗的愈伤率无显著差异，但4年生母树插穗的生根率为0，与1年生的差异显著。

表3 不同采穗时期对不同年龄纳塔栎插穗生根的影响

从采穗日期和母树年龄的双因素分析表可以看出(表4)，二者交互作用时，一级根数不存在差异性；而经激素处理后不同采穗日期、母树年龄的插穗，其愈伤率、生根率、一级根数、平均根长均存在极显著差异。采穗日期对生根率、平均根长的影响大于母树年龄对二者的影响，而母树年龄对插穗的愈伤率、一级根数的影响较大。由此可以看出，采穗日期与母树年龄的交互作用影响纳塔栎的扦插生根，采穗日期对生根率的影响更大。

表4 不同采穗日期和母树年龄对生根指标影响的双因素分析

2.3 生根过程中插穗内抑制物的GC-MS鉴定

在纳塔栎生根前期(扦插当天)、中期(扦插后21 d)、后期(扦插后31 d)，分别对插穗甲醇提取物进行GC-MS分析，得到总离子流色谱图(图1、图2、图3)。通过质谱系统检索并与标准图谱进行核对，选择总离子流色谱图中峰面积较大且与计算机检索谱库图吻合性较好的有机化合物(表5)。

图1 扦插前期纳塔栎插穗甲醇提取物总离子流色谱图

图2 扦插中期纳塔栎插穗甲醇提取物总离子流色谱图

图3 扦插后期纳塔栎插穗甲醇提取物总离子流色谱图

扦插前期，在纳塔栎韧皮部甲醇提取物中共鉴定出16个峰，其中峰面积较大、相似度较高的化合物主要有8种(见表5)，包括酚酸醇类物质4种，分别是邻苯三酚(13.40%)、对羟基苯乙醇(4.81%)、正癸酸(50.40%)、γ-谷甾醇(14.20%)，另外还含有维生素E(2.30%)、桦木脑(3.72%)。

表5 纳塔栎插穗甲醇提取物中有机化合物种类及相对百分比

扦插中期，出现了一种新的化合物棕榈酸，其相对百分比为1.21%。与扦插前期相比，邻苯三酚、正癸酸的相对百分比有所减少，而对羟基苯乙醇、棕榈酸、γ-谷甾醇、桦木脑的相对百分比上升。其中，邻苯三酚相对百分比下降了3.41%；正癸酸相对百分比下降的幅度最大，由最初的50.4%下降至28.5%，下降了21.9%；对羟基苯乙醇、桦木脑的相对百分比分别上升了2.05%、1.63%；γ-谷甾醇相对百分比上升幅度最大，由14.2%上升至30.4%，上升了16.2%。

在扦插后期，未检测到对羟基苯乙醇、正癸酸2种物质。邻苯三酚相对百分比较中期上升了1.31%，为11.3%；棕榈酸相对百分比较中期下降了0.16%；γ-谷甾醇相对百分比较中期上升了21.8%，且其占比最高，为55.26%；桦木脑的相对百分比较中期上升了1.85%。

总的来说，在整个生根过程中，邻苯三酚相对百分比呈先下降后上升的趋势；对羟基苯乙醇、棕榈酸相对百分比呈先上升后下降的变化趋势；γ-谷甾醇、桦木脑的相对百分比均呈上升趋势；正癸酸的相对百分比则呈现下降趋势。

3 结论与讨论

3.1 母树年龄对纳塔栎插穗生根的影响

有研究表明，很多树种扦插时的生根率会随母树年龄的增加而降低[7]。母树年龄越小，其细胞分裂能力越强，生理活动越活跃，插穗越容易生根[8]。本研究中，处理组、对照组1年生纳塔栎插穗的生根率均高于4年生母树的插穗，且其他指标也优于后者，这与秦爱丽等[9]对崖柏(Thujasutchuenensis)嫩枝扦插、李俊南等[10]对薄壳山核桃(Caryaillinoensis)扦插的研究结果一致。对照组4年生母树插穗的生根率为0，而1年生纳塔栎插穗的生根率可达10.3%，说明母树年龄对纳塔栎扦插生根有很大影响，树龄越小，越容易生根。双因素分析表明，母树年龄、处理方法及二者的交互作用都与纳塔栎插穗生根存在显著或极显著关系。其中，激素处理对纳塔栎插穗生根的影响效果较母树年龄更大。

3.2 采穗时期对纳塔栎生根的影响

采穗时期不同，插穗中的营养物质、木质化程度及外界环境不相同，因而扦插生根率也会有差异。幼嫩插穗组织分生能力强，易产生愈伤组织，容易经过脱分化成形成根原基，因而扦插生根率较高[11]。施浩威等[12]研究了插穗木质化程度对红翅槭(Acerfabri)扦插生根的影响并发现半木质化嫩梢的扦插效果最好。纳塔栎的年生长周期为4～8月[13]，本研究采用半木质化(8月、9月)、木质化(11月)的插穗进行扦插，研究发现，4年生母树充分木质化的插穗完全不能生根，即使从1年生苗木剪取的插穗，其生根率也只有20.2%；而8月、9月采用半木质化的插穗进行扦插，其生根率均高于11月木质化插穗，其原因是木质化插穗虽有一定的营养基础，但组织内的生理活动不强烈，且随着木质化程度的加深，生根抑制物的含量也会逐渐增加，最终影响插穗的生根率。因此，纳塔栎扦插时可以选择当年新抽生的半木质化枝条作插穗。

同为半木质化的插穗，在8、9月2个采穗时期进行扦插，纳塔栎的生根效果也不尽相同。1年生母树，8月份扦插的生根率(88.8%)较9月份(85.3%)略高，但二者之间差异不显著；4年生母树，8月份扦插的生根率(62.9%)显著高于9月份(50.3%)，原因可能是夏季植物生长旺盛，植物体内诱导生根的相关酶活性、内源激素水平高[14]。纳塔栎在4月初开始抽枝展叶，本研究未能剪取春天刚萌动的嫩枝进行扦插试验，今后有必要更系统的研究其他采穗时期对纳塔栎生根的影响，找到更多适宜纳塔栎扦插的时期，以提高繁殖系数。采穗日期、母树年龄的双因素分析结果显示，除一级根数在二者的交互作用中不存在差异性，其余各相关指标均存在极显著差异，说明采穗日期、母树年龄均为影响纳塔栎扦插的重要因素。这与王小蓉等[15]对日本晚樱(Cerasusserrulata)扦插中得出的插穗生理成熟度过高，不利于不定根发生的结论一致。

3.3 激素处理对纳塔栎插穗生根的影响

利用外源激素处理插穗，可优化插穗内有关不定根形成的物质，如内源激素水平、营养物质分配等[16]。但激素质量浓度过高会伤害插穗，反而抑制其生根[17]。对于难生根的树种，使用适宜种类、质量浓度的外源激素处理插穗，可有效提高扦插生根率，且很多树种混合激素溶液处理比单一激素处理的生根效果更好[18-19]。本研究在预试验的基础上，采用IBA、NAA、THB的混合溶液处理插穗，1年生、4年生母树的插穗生根率均高于未处理插穗，一级根数、平均根长指标也优于对照组，且完全木质化的1年生母树的枝条经过处理后也有20.2%的生根率，说明混合激素处理可有效调节插穗内物质的分配水平，促进扦插生根。这与高林等[20]对石生茶藨子(RibesSaxatilePall.)、李梦怡等[21]对红花槭(Acerrubrum)的研究结果一致。

3.4 抑制物对纳塔栎生根的影响

以往的研究表明，酚类、酸类、黄酮类物质是主要的生根抑制物质[22-23]。朱鹏等[24]采用GC-MS技术，在邓恩桉(Eucalyptusdunnii)插穗中鉴定出了醇类及其衍生物，该研究认为难生根的树种韧皮部存在抑制生根的物质。王改萍等[25]采用GC-MS技术，研究了楸树(Catalpabungei)生根过程中插穗内抑制物质的种类、含量变化，根据扦插过程中植物甾醇相对百分比上升，槲皮素、亚油酸、棕榈酸的相对百分比下降，推断植物甾醇为楸树生根促进物质，槲皮素、亚油酸、棕榈酸为生根抑制物质。本研究采用GC-MS技术，以1年生苗木的半木质化插穗为材料，测定了纳塔栎生根前、中、后期3个不同阶段有机物的种类及其相对百分比的变化，从中鉴定出了邻苯三酚、桦木脑、正癸酸、维生素E、γ-谷甾醇等物质。纳塔栎插穗整个生根过程中，γ-谷甾醇、桦木脑的相对百分比均呈上升趋势，且分别升高了38.04%、3.48%。有研究表明，桦木脑是一种参与生物体多功能调节的生物活性物质[26]。徐程杨等[27]指出某些酚醇类物质可能是内源生长素的增效剂。8月份扦插的插穗中γ-谷甾醇、桦木脑相对百分比高，推断是其生根率较高的原因之一。因此初步推断，γ-谷甾醇、桦木脑是具有促进生根活性的化合物。梁小春等[28]在邓恩桉插穗生根抑制物的研究中发现，酚类物质是影响其扦插生根的物质；而Rout[29]对茶树(Camelliasinensis)扦插生根的研究发现，多酚类物质可以促进茶树生根。本研究中，邻苯三酚的相对百分比在生根过程中呈先下降后上升的变化趋势，因此邻苯三酚在纳塔栎生根过程中的作用比较复杂，不能判断其具体的作用。在生根过程中，正癸酸的相对百分比一直呈下降趋势，生根后期则基本检测不到正癸酸，因此初步推断正癸酸是纳塔栎扦插生根的主要抑制物质，今后有必要进一步验证上述物质对纳塔栎生根的影响。王艳晶[30]在对国槐(Sophorajaponica)扦插研究中发现，国槐嫩枝存在抑制物质，且在不同生长时期抑制物的含量有所差异。因此，不同采穗时期的抑制物研究也是今后要做的主要工作之一。

植物扦插生根是1个复杂的过程，受多重因素的影响。本研究从母树年龄、采穗时期、生根抑制物质3个角度出发，阐明了影响纳塔栎扦插生根的因素，但对于生根抑制物，本研究仅依据纳塔栎生根进程中相关物质的变化趋势，初步推断了这些物质对其生根进程的影响，后续研究中仍需进一步验证这些物质在纳塔栎生根过程中的具体作用机理。此外，影响插穗生根的因素还有很多，如插穗内部的激素水平、营养基础及相关酶活性的高低等，而外界环境因素、扦插基质的不同也会影响插穗生根率[31]。今后有必要进一步研究更多因素对纳塔栎扦插的影响，为难生根树种的扦插繁殖提供参考。