不同精粗比日粮对黑藏羊肺组织形态发育、抗氧化酶活性及其mRNA表达的影响

周 力，张峰硕，桂林生，侯生珍

(青海大学农牧学院，西宁 810016)

【研究意义】青海黑藏羊俗称贵德黑裘皮羊，主要集中分布于青海省海南藏族自治州贵南县[1]。黑藏羊具有体格较大、体质结实，肌肉发育适中，繁殖性能强，生长速度较快，且肉质细嫩多汁，膻味轻，风味好等特性[2]。最主要的特点为全身被毛及皮肤为纯黑色，随着年龄增大毛色逐渐变成黑红或灰色[3]。由于早期对该品种保护意识不强，造成种群数量锐减，几乎濒临灭绝。近年来，黑藏羊产业正从生产裘皮向肉用转型，此时若能了解黑藏羊的品种特性对于调动当地牧民养殖积极性，提高经济效益具有重要意义。【前人研究进展】肺是氧气运输的调控中心，反刍动物通过肺从外界环境摄取氧气，并且为机体提供所需的氧分子[4]。为了适应高原低氧环境，动物肺部结构会发生明显的生理变化[5]。目前，许多学者都是围绕藏系绵羊生长发育[6]、饲养方式[7]、营养需求[8]以及肌肉品质[9]等方面进行了大量研究，但对青海特色资源黑藏羊的研究相对匮乏，关于其肺组织适应低氧环境的遗传机制更是未见相关报道。【本研究切入点】研究黑藏羊的低氧适应机制对于推动畜牧业的发展具有重要的意义，同时低氧是癌症等重大疾病产生的重要原因，进行低氧适应原理的研究，也可为高原疾病的治疗提供相应思路。【拟解决的关键问题】本试验拟以生活在高寒牧区的黑藏羊为试验对象，通过研究不同精粗比日粮对育成期黑藏羊肺形态发育、抗氧化酶活性及其相关基因表达的影响，以期为肉羊的饲养管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

饲养试验于2021年2—6月青海省海南州贵南县黑藏羊繁育中心进行，试验期128 d，其中预试期8 d，正试期120 d。

1.2 试验设计

试验选择60只体况良好、体重相近(10.45±0.96)kg的2月龄断奶黑藏羊，随机分为3个处理组，每组20只，每组5个重复，每个重复4只。分别饲喂精粗比为70∶30、50∶50和30∶70的日粮。试验期间每天08:00和17:30将精料与粗料搅拌混匀后饲喂羔羊，粗饲料由燕麦青贮和燕麦青干草组成(以干物质1∶1计)，自由采食和自由饮水。日粮设计参考中国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)以及结合当地藏羊饲养实际情况进行饲粮的配制，其日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平(干物质基础)

1.3 样品采集与处理

饲养试验结束后，每组中随机选取5只黑藏羊于清晨空腹屠宰(禁食12 h、禁水2 h)，然后迅速剪取每只试验羊右侧的肺脏组织两份，其中一份放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用于观察组织形态学，另一份置于液氮中，用于抗氧化酶活性及其相关基因的测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 肺组织形态发育的测定 试验采用常规石蜡进行包埋，利用苏木精—伊红(HE)染色法进行染色。应用电脑Imaginge pro plus 6.0软件和OlympusBX 51显微镜进行观察和拍照，测量指标包括：肺泡隔厚度、单个肺泡面积、单位面积肺泡数、血管数、血管直径、中膜厚度以及中膜厚度/血管直径。每个样本观察3张非连续切片，每张切片选取5个视野，每个视野分别测定3组数据，结果取其平均值。

1.4.2 肺组织抗氧化酶活性的测定 从液氮中取肺脏样品，经过研磨，用生理盐水稀释成10%组织匀浆，-20 ℃保存。抗氧化酶活性指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，购自江苏酶标生物科技有限公司。

1.4.3 抗氧化酶相关基因表达的测定 采用Trizol法提取肺组织的总RNA，RNA的浓度和质量通过OD260/280和琼脂糖凝胶电泳进行。检测合格后利用北京天根生化科技有限公司提供的FastKing RT kit cDNA的第一链合成试剂盒将提取的总RNA进行反转录。利用罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪测定SOD、CAT和GSH-Px基因的mRNA相对表达量。反应体系为20 μL，其中包括1.0 μL cDNA模板、10 μL 2× SuperReal Color PreMix和正、反游引物各0.6 μL，用RNasc-free ddH2O补足至20 μL。反应条件为∶95 ℃预变性15 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，循环数为40。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，目的基因的相对表达量采用2-△△CT法[10]计算。引物均由上海生工公司负责合成，引物序列见表2。

表2 引物序列及参数

1.5 数据统计分析

初始数据经过 Excel 2019整理，应用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，试验结果均以“平均值±标准差”(Mean±SD)表示，以P<0.05作为显著性判断的标准。

2 结果与分析

2.1 不同精粗比日粮对黑藏羊肺脏发育的影响

2.1.1 黑藏羊肺组织HE染色结果 采用HE染色法对各组黑藏羊肺组织进行染色，在20×10倍的显微镜下观察，标尺为50 μm，结果如图1所示。

Ⅰ:肺泡；Ⅱ血管；Ⅲ:中膜；Ⅳ:肺泡隔Ⅰ:Alveolus; Ⅱ:Blood vessels; Ⅲ: Membrane; Ⅳ: Alveolar septum图1 不同精粗比日粮下黑藏羊肺组织HE染色结果Fig.1 HE staining results of lung tissues of black Tibetan sheep under different diets of concentrate to forage ratio

2.1.2 不同精粗比日粮对黑藏羊肺组织发育的影响 由表3可知，70∶30组和50∶50组肺泡隔厚度显著高于30∶70组(P<0.05)。50∶50组单个肺泡面积显著低于30∶70组(P<0.05)，但较70∶30组差异不显著(P>0.05)。70∶30组和30∶70组单位面积肺泡数显著低于50∶50组(P<0.05)。

表3 日粮精粗比对黑藏羊肺泡相关测量值的影响

由表4可见，70∶30组血管直径显著高于50∶50组和30∶70组(P<0.05)。50∶50组和30∶70组中膜厚度显著低于70∶30组(P<0.05)。各组间中膜厚度/血管直径和单位面积血管数差异不显著(P>0.05)。

表4 日粮精粗比对黑藏羊血管相关测量值的影响

2.2 不同精粗比日粮对黑藏羊肺组织抗氧化酶活性的影响

黑藏羊肺组织抗氧化酶活性结果如表5所示，50∶50组超氧化物歧化酶活性显著大于70∶30组(P<0.05)，较30∶70组差异不显著(P>0.05)。70∶30组过氧化氢酶活性显著小于其他2组(P<0.05)。30∶70组谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于70∶30组(P<0.05)，较50∶50组差异不显著(P>0.05)。

表5 日粮精粗比对黑藏羊肺组织抗氧化酶活性的影响

2.3 不同精粗比日粮对黑藏羊肺组织抗氧化酶mRNA表达的影响

由图2可知，50∶50组SOD和CAT基因的mRNA表达量显著高于70∶30组(P<0.05)，但与30∶70组差异不显著(P>0.05)。30∶70组GSH-Px基因的mRNA表达量显著高于70∶30组(P<0.05)，但与50∶50组差异不显著(P>0.05)。

图2 黑藏羊肺组织mRNA相对表达量Fig.2 Relative mRNA expression in lung tissue of black Tibetan sheep

3 讨 论

3.1 不同精粗比日粮饲粮对黑藏羊肺组织形态发育的影响

在长期的自然选择与进化过程中，生活在青藏高原及其附近地区的动物，其肺部结构会发生了一系列变化来更好的适应高原低氧环境，并且能够增加氧气的摄入、运输和扩散能力[11]。因此，以“高原黑珍珠”之称的黑藏羊为试验对象探讨青藏高原土著动物的低氧适应机制具有重要的意义。研究发现，相较于180日龄平原黄牛的肺泡组织结构，180日龄高原牦牛肺泡隔厚度、单个肺泡面积和单位面积内肺泡数之间差异均不明显，但单位面积内肺泡面积显著增大，有利于高原牦牛在低氧环境下的气体交换[12]。冯秋菊等[13]同样指出，与平原同类动物相比，高原土著动物更有利于低氧环境下的气体交换，其原因与体内单位面积内的肺泡数较多和肺泡隔较厚有关。此外，贾荣莉[14]试验也证实，藏羊肺组织中肺泡较小，单位面积肺泡数量多，单位面积血管数量较多，有助于藏羊增加肺部氧气的摄入和转运。基于上述人员研究结果可以看出，反刍动物肺脏发育状况与其机体适应高原低氧的环境具有紧密的联系。在本试验中，相较于70∶30组与30∶70组，50∶50组黑藏羊肺组织发育较佳。其原因可能是日粮中的适宜精料水平能够促进瘤胃发酵。增加对营养物质的消化吸收，但精料添加过高，也会使瘤胃产酸增加，继而影响机体正常的生长发育。

3.2 不同精粗比日粮对黑藏羊肺组织抗氧化酶活性的影响

当体内抗氧化能力降低时，会造成活性氧自由基数量急剧上升，发生氧化还原反应，引起氧化损伤与细胞功能失调，从而影响机体健康[15]。而SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶能够清除有害的氧自由基，以达到保护的目的[16]。其中，SOD作为生物体内氧自由基的天然清除剂，其活性能够反映机体清除氧自由基的能力[17]。CAT可以特异性清除体内过多的过氧化氢，保护细胞免受过氧化损伤[18]。而GSH-Px是分解体内过氧化物的重要分子，消除细胞内的过氧化氢及脂质自由基，有利于维持细胞膜结构的完整[19]。以贵州黑山羊为研究对象，发现日粮精料水平由22%提高至66%时，可以提高血浆中T-AOC、SOD、GSH-Px水平，并且能够降低MDA含量，其抗氧化应激能力持续增强[20]。Sgorlon等[21]指出，当饲粮中精料水平由30%增长到55%时，母羊血液抗氧化应激能力持续增加。侯志高等[22]在荷斯坦奶牛上也得到类似的结论。以上研究均证实营养物质的缺乏和不平衡均不能满足反刍动物营养需要，甚至导致体内自由基数量不断蓄积，从而扰乱氧化应激的平衡状态，发生氧化应激反应。从本试验来看，当日粮精粗比为50∶50时，能够提高肺组织中SOD、CAT和GSH-Px活性。可能是由于适宜的营养水平日粮在一定程度上使体内自由基的产生和消除处于可调控范围，平衡氧化应激状态，从而提高黑藏羊抗氧化应激的能力。此外，本试验也发现，日粮精粗比与黑藏羊肺组织的SOD、CAT和GSH-Px基因的mRNA表达量存在密切的联系，其机理有待接下来深入的研究。

4 结 论

在本试验条件下，适宜的精粗比日粮有利于促进黑藏羊肺组织形态发育，并增强其抗氧化能力，其中精粗比为50∶50的日粮饲喂效果较佳。