微生物菌剂联合叶面硅、铁对水稻Cd积累分布的影响

王强锋，李 芹，侯 勇，夏中梅，王海涛，陈 春，杨云月，杨蕤兰，胡 甦

(1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所, 成都 610066; 2.四川省兰月科技有限公司, 成都 610207)

【研究意义】水稻是我国主要粮食作物之一，对土壤中的Cd具有较强的吸收积累能力，而稻田Cd污染已严重危害人体健康[1]。采取有效手段阻隔水稻Cd吸收、减少籽粒Cd积累是中低Cd污染农田安全利用的必要措施。因此，研究微生物根际钝化—叶面阻控技术联合对水稻植株Cd积累、分布的影响，有助于科学地指导镉污染农田的水稻安全生产。【前人研究进展】水稻可食部位Cd的积累主要受根系Cd的吸收、Cd向地上部转移和再分配等生理过程的共同影响[2]。降低稻米Cd含量总体来说有两大途径：一是减少植株从土壤中吸收Cd;二是阻控Cd向地上部(籽粒)的转移。植物从土壤溶液中吸收有效态Cd，土壤原位钝化可有效降低Cd的移动性和有效性，近年来发现微生物是一类重要的钝化修复剂[3]。土壤中的部分微生物对Cd有很强的耐受性，并能与Cd发生吸附、沉淀、富集等多种作用进而减少Cd在土壤中的迁移[4]。由于不同微生物分泌的胞外聚合物、无机盐等存在较大差异，因此微生物对Cd的钝化与其种类有关[5-6]。芽孢杆菌(Bacillus)具有较高的环境兼容性，且对重金属Cd具有较好的吸附效果；肠杆菌(Enterobacter)对Cd具有一定耐性且对植物有促进作用，可促进植物光合作用，增强重金属胁迫下植物抗氧化能力，在土壤Cd污染修复上具有较大的研究价值[7-9]。除了阻隔作物对Cd的吸收外，减少Cd向地上部(籽粒)的转移也有利于降低Cd进入食物链的风险。叶面阻控技术是近些年降低农作物对重金属吸收的新方法，硅、铁等元素常用于水稻Cd吸收的叶面阻控剂[10]。硅作为水稻生长的有益元素，可增强细胞壁的机械性能，改变Cd的化学形态和亚细胞分布，进而减少Cd向地上部的转移[11-12]。叶面喷施硅可以使水稻籽粒Cd含量降低28%～50%[13]。铁肥作为叶面阻控剂，对水稻Cd吸收的影响与其种类及施用方式有关，其中，EDDHA-Fe叶面喷施水稻Cd积累降幅较大，稻米Cd含量减少约20%[14]。【本研究切入点】在田间实践中发现，虽然大多数措施都能够减少农作物中的重金属，但没有一项单独的技术能够使作物达到国家粮食安全标准，多种技术集成被认为是最佳的解决方案[15]。同时，与传统的磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐等碱性物质和粘土矿物类钝化材料相比，微生物菌剂和叶面阻控剂对土壤原本物化性质改变较小，具有更好的应用潜力[16]。因此，以“微生物+叶面肥”联合阻控的方式，探究其对水稻植株生长和Cd积累的影响，对实现中轻度Cd污染农田的安全利用具有重要意义。【拟解决的关键问题】采用不同的微生物菌剂调理土壤并联合叶面喷施硅、铁元素的方法，探讨水稻Cd吸收、转移特征的变化，以期筛选出更好的技术组合，实现中轻度Cd污染农田的安全生产。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物：水稻(宜香优2115)。

供试药剂：生物活性有机硅: 有效成分为1-氯甲基杂氮硅三环，SiO2含量2.86%，有机质含量83.79%，pH 6.67，由俄罗斯自然科学院提供；螯合铁：EDDHA-Fe，Fe含量6%；2种微生物菌剂(有效活菌数2亿/g的粉剂)：主要成分分别是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)，由四川省兰月科技有限公司提供。有研究证明解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和路德维希肠杆菌(E.ludwigii)对Cd具有固定、阻隔效应[17-19]。

1.2 试验设计与处理

试验于2019年4—9月在四川省什邡市双盛镇进行，试验地属中纬度亚热带湿润气候，平均海拔507 m，年平均气温15.2 ℃。土壤类型为水稻土，常年水稻—小麦轮作，土壤pH 6.69，全Cd含量为0.57 mg/kg，有效Cd含量为0.24 mg/kg。

试验设叶面肥、微生物菌剂及其联合处理。其中，叶面肥为有机硅稀释5000倍与EDDHA-Fe稀释3000倍的混配液，在水稻拔节期和抽穗期喷雾处理(编号Y)。微生物菌剂在水稻移栽前使用，以450 kg/hm2的用量与土壤混合均匀，试验采用以芽孢杆菌和肠杆菌为主要活性成分的微生物菌剂，设单独处理(编号D1、D2)和基施微生物菌剂的同时喷施叶面肥联合处理(编号D1+Y、D2+Y)。以清水为对照，共6个处理(表1)，每处理3个重复。将田块划分为18个3.0 m × 2.0 m 的试验小区，小区四周起垄并用聚乙烯薄膜相互间隔，防止小区之间水、肥相互渗透。每小区为1个试验单元，水稻株行距为20 cm × 25 cm，水肥管理和病虫害防治同当地常规栽培管理方式(表1)。

表1 试验设计与处理

1.3 样品采集制备及Cd含量测定

水稻成熟期采样，每小区采集2株为一个混合样，每处理采集3个重复。样品经水冲洗后，将根部浸泡于20 mmol/L Na2-EDTA溶液中15 min，用去离子水润洗后吸水纸擦干，将其分为根、茎、叶和籽粒。植株105 ℃杀青30 min，再75 ℃烘干至恒重，籽粒自然风干，粉碎用于Cd含量的测定。植株Cd含量采用HNO3-H2O2消化，石墨炉原子吸收分光光度计测定Cd含量。

1.4 数据处理与分析

Cd积累量、分配比例、转移系数(Transfer factor，TF)的计算公式如下。

Cd积累量 = Cd含量×生物量

分配比例(%) = 某部位Cd积累量/整株Cd积累量×100%

TF根—秸秆= 秸秆Cd含量/根部Cd含量；TF秸秆—籽粒= 籽粒Cd含量/秸秆Cd含量[20]

不同处理水稻生物量和镉含量采用DPS 11.0进行统计分析，并用LSD法进行多重比较(P<0.05)；不同处理各器官镉含量、分配比例和转移系数使用Origin 9.0和Excel 2013进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 2种微生物菌剂和叶面肥单独及组合应用对水稻生物量的影响

由表2可知，与对照相比，有机硅和螯合铁作为叶面肥使用，水稻各部位的生物量无显著变化。2种配方的微生物菌剂施入土壤对水稻的生长有不同的影响，芽孢杆菌处理条件下水稻地上部长势略优于对照，而肠杆菌处理条件下水稻地上部生物量降低。与单独使用微生物菌剂相比，芽孢杆菌与叶面肥联合处理条件下水稻植株生物量减小，茎、叶生物量显著降低；肠杆菌与叶面肥联合处理对水稻的生长无明显影响。

表2 微生物菌剂和叶面肥处理对水稻各部位生物量的影响

2.2 2种微生物菌剂和叶面肥单独及组合应用对水稻各部位Cd含量的影响

由图1可知，水稻根部Cd含量以路德维希肠杆菌菌剂联合叶面肥处理(D2+Y)最高(8.94 mg/kg)，以解淀粉芽孢杆菌菌剂联合叶面肥处理(D1+Y)最低(3.23 mg/kg)；茎部Cd含量以路德维希肠杆菌菌剂处理(D2)最高(2.97 mg/kg)，以解淀粉芽孢杆菌菌剂处理(D1)最低(1.07 mg/kg)；叶部Cd含量以常规种植(CK)最高(1.47 mg/kg)，以路德维希肠杆菌菌剂联合叶面肥处理(D2+Y)最低(0.61 mg/kg)；籽粒Cd含量以解淀粉芽孢杆菌菌剂处理(D1)最低(0.25 mg/kg)，以路德维希肠杆菌菌剂处理(D2)最高(0.41 mg/kg)。不同处理的水稻各部位镉含量为根﹥茎﹥叶﹥籽粒。与对照相比，叶面肥单独使用下水稻茎部和籽粒中Cd含量无显著差异；叶部Cd含量显著低于对照，降幅约49.6%。芽孢杆菌处理下水稻叶部、籽粒Cd含量均显著低于对照，Cd含量分别降低52.3%、28.6%；肠杆菌处理下水稻根部、茎部、籽粒Cd含量显著高于对照，叶部Cd含量显著低于对照，增加了Cd向籽粒的运输。

图中横轴大写字母“Y”表示叶面喷施有机硅和鳌合铁；“D1”和“D2”分别表示芽孢杆菌和肠杆菌菌剂。柱状图上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同The capital letters ‘Y’ in lateral axis means foliar fertilization of organosilicone and EDDHA-Fe. The capital letters ‘D1’ and ‘D2’ in lateral axis mean microbial agents derived from Bacillus and Enterobacter, respectively. Different small letters above the bars mean significant difference among treatments (P < 0.05). The same as below图1 微生物菌剂和叶面肥处理对水稻各器官Cd含量的影响Fig.1 Effects of leaf fertilizer and microbial agents on Cd content in different organs of rice

与对照相比，2种微生物菌剂与叶面肥联合处理对水稻籽粒、茎部Cd含量无显著影响；芽孢杆菌与叶面肥联合处理下，水稻根部、叶部Cd含量显著降低；肠杆菌与叶面肥联合处理下，水稻根部Cd含量显著增加，叶部Cd含量显著降低。相较于微生物菌剂单独处理，2种配方联合叶面肥技术对水稻Cd积累的影响存在明显的差异，芽孢杆菌联合叶面肥处理下，水稻根部Cd含量显著降低，籽粒Cd含量显著升高，茎、叶部Cd含量无明显变化；肠杆菌联合叶面肥处理下，水稻根部Cd含量显著升高，茎、叶、籽粒Cd含量均显著低于肠杆菌单独处理，可见肠杆菌与叶面肥联合使用可减少Cd向水稻地上部运输。

图2 微生物菌剂和叶面肥处理对水稻Cd积累量和分配比例的影响Fig.2 Accumulation of Cd in plants and the proportion of Cd in different organs of rice treated with microbial agents and leaf fertilizer

2.3 2种微生物菌剂和叶面肥单独及组合应用对水稻Cd积累量和分配比例的影响

由图2-A可知，微生物菌剂和叶面肥处理对水稻植株Cd的积累有明显的影响。与对照相比，叶面肥、芽孢杆菌菌剂单独处理下，水稻Cd积累量降低；肠杆菌单独处理下，水稻Cd积累增加；2种微生物菌剂与叶面肥联合处理下，水稻Cd积累量降低。2种微生物菌剂联合叶面肥处理下，水稻Cd积累量均低于微生物菌剂单独处理，说明叶面肥可减少水稻Cd的积累。叶面肥与芽孢杆菌菌剂联合处理下，水稻整株Cd积累量较小，比对照降低约40.2%。

分析Cd在水稻各部位的分布(图2-B)可知，微生物菌剂和叶面肥对Cd在水稻根部、秸秆的分布具有较大的影响，推测可能参与调节Cd的转移过程。与对照相比，叶面肥单独处理下水稻根部Cd分配比例明显增加，秸秆Cd分配比例降低，减少了Cd向地上部的转移；2种微生物菌剂单独处理，水稻Cd分布无明显变化。与微生物菌剂单独处理相比，2种微生物菌剂联合叶面肥处理下水稻Cd分配比例变化趋势不同，表明菌剂联合叶面肥处理可改变水稻植株Cd的分布。与芽孢杆菌菌剂单独处理相比，联合叶面肥处理下水稻根部Cd减少约21.6%，秸秆和籽粒Cd分布增加，其中籽粒Cd积累量是芽孢杆菌菌剂单独处理的1.51倍；与肠杆菌菌剂单独处理相比，联合叶面肥处理下水稻根部Cd增加约57.7%，秸秆和籽粒Cd分布明显减少。可见，芽孢杆菌菌剂与叶面肥联合处理可促进Cd向水稻植株上部转移，而肠杆菌菌剂与叶面肥联合处理则增加Cd在根部的积累。

2.4 2种微生物菌剂和叶面肥单独及组合应用对水稻Cd转移系数的影响

转移系数(Transfer factor)可在一定程度上反映出植株对Cd的转移能力。对照处理条件下，水稻中镉从根到秸秆的转移系数(TF根—秸秆)大于从秸秆到籽粒的转移系数(TF秸秆—籽粒)，表明Cd容易由根向地上部转移，由秸秆向籽粒转移较少。与对照相比，叶面肥、芽孢杆菌菌剂单独处理水稻TF根—秸秆明显减小，TF秸秆—籽粒增大，Cd滞留在根部增多，向地上部转移较少；肠杆菌菌剂处理下，水稻TF根—秸秆提升，TF秸秆—籽粒无显著变化，Cd向地上部转移增多。与微生物菌剂单独处理相比，2种配方的微生物菌剂联合叶面肥处理转移系数的变化存在较大差异。芽孢杆菌菌剂联合叶面肥处理下，水稻TF根—秸秆相较于孢杆菌菌剂单独处理明显提升，是芽孢杆菌菌剂单独处理的1.72倍，增加了Cd向地上部的转移。肠杆菌菌剂联合叶面肥处理下，水稻TF根—秸秆较于肠杆菌菌剂单独处理明显减小，是肠杆菌菌剂单独处理的30.5%，而TF秸秆—籽粒增大约61.9%，Cd向地上部转移大幅减少。

图3 微生物菌剂和叶面肥处理对水稻Cd转移系数的影响Fig.3 The transfer factors of Cd in rice treated with microbial agents and leaf fertilizer

3 讨 论

稻米中Cd的积累增加了人体摄入Cd的风险，Cd污染农田的安全利用是保障国民健康和农业可持续发展的重要前提。土壤钝化、叶面阻控分别在这两大过程中发挥作用，是减少水稻Cd吸收、积累的重要手段，近年来应用广泛。在土壤钝化方面，微生物可调节重金属的移动性和有效性，比化学/矿物钝化剂对环境更友好，同时具有调节作物生长的特性，是良好的生物钝化材料。已有研究发现，多种微生物(细菌、真菌)如芽孢杆菌、根霉菌、酵母菌等对重金属具有较强的耐性，在修复农田土壤方面具有较大的应用潜力[21-22]。前期试验发现芽孢杆菌属、肠杆菌属的某些菌株可降低土壤中Cd的有效性，阻隔作物对Cd的吸收[17-19]。本试验中2种菌剂施入土壤后，水稻植株Cd积累以芽孢杆菌菌剂处理较低，以单独肠杆菌处理最高，表明微生物对土壤重金属的活性和植物生长的影响与其种类有关。芽孢杆菌和肠杆菌细胞壁表面的功能基团对Cd均有吸附作用，可通过吸附固定、胞内累积、改变土壤理化性质等方式降低Cd的移动性和有效性[6-7,23]。在土壤—植物系统中应用，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)可增加香蒲植株Cd的吸收，而巨大芽孢杆菌(B.megaterium)可阻控辣椒果实中Cd的积累，可见芽孢杆菌属对植物Cd吸收的影响存在明显的种间差异[24-25]。肠杆菌对Cd具有较强的抗性，施入土壤可降低根际土壤pH，促进积雪草、蓼科、油菜等植物对Cd的吸收，同时增强植物对Cd的耐受性[8-9,26]，本试验结果与之一致。基施芽孢杆菌菌剂可降低水稻植株Cd积累量，减少根部Cd的吸收及向秸秆的转移；肠杆菌则表现为促进水稻对Cd的积累，根部和秸秆中Cd积累增加约10%。

在叶面阻控方面，硒、铁、硅、锌等营养调控可有效降低稻米Cd的积累[27-29]。Cd可借助铁、锌、锰、磷、硅等元素的转运通道/蛋白在水稻植株内转移，硅、铁等营养元素的补充可减少Cd在水稻植株内的转移，并促进水稻的生长。本试验中，生物活性有机硅可提供硅元素，同时也是一种新型的植物生长调节剂，与螯合铁作为混合叶面肥，在拔节期和抽穗期喷施可降低水稻植株Cd积累量，有效阻隔Cd向地上部转移，使地上部Cd分配比例降低17.2%。

单一阻控技术作用特点各有侧重，降低水稻Cd积累的效果有限，多种技术的联合使用能够更大效率地发挥降Cd作用，可提高中轻度污染稻田的安全利用率，推广应用潜力更大[15,30]。目前，筛选Cd低积累品种、土壤钝化、叶面阻控、水肥管理等是几种常用于Cd污染农田安全利用的技术手段，其中土壤钝化与叶面阻控联合是降Cd效果较好、操作便捷、适用于水稻生产的一种联合降Cd技术。大部分研究以矿物肥料作为土壤钝化剂与叶面阻控联合使用，有较为明显的降Cd效果，籽粒Cd含量降低50%以上[31-32]。相比于矿物型土壤钝化剂，微生物菌剂施入土壤具有环境友好、土壤负担较小、调节植物生长的多重优势，与叶面硅肥联合使用可促进水稻产量升高，并使糙米Cd含量降低约22%[33]。本试验结果表明，芽孢杆菌菌剂与叶面硅、铁联合使用，水稻植株Cd积累量比芽孢杆菌菌剂单独使用降低14%～20%。芽孢杆菌菌剂与叶面硅、铁联合使用对水稻植株各部位Cd的分布有不同的影响。芽孢杆菌菌剂单独使用可降低水稻植株Cd积累，但与叶面硅、铁联合使用会促进Cd向水稻地上部转移；肠杆菌菌剂单独使用会导致水稻植株Cd积累增加，与叶面硅、铁联合使用可增强根系Cd的滞留，有利于阻控Cd在地上部的积累。肠杆菌菌剂联合叶面硅、铁肥或许能够增加植株对土壤中Cd的吸收，但可能增加Cd向籽粒转移的风险，这种模式在植物提取修复中值得尝试。目前来看，微生物菌剂对土壤Cd活性和植物生长具有双向调节作用，且因微生物种属不同而存在较大差异，在与叶面阻控技术的联合使用上作用机理较为复杂，配套降Cd方案尚不成熟，仍需深入探索和广泛试验。

4 结 论

(1) 叶面喷施有机硅和螯合铁可降低水稻Cd积累，减少地上部Cd分配，阻隔Cd向地上部转移和积累。

(2) 单独使用2种微生物菌剂对水稻Cd的积累影响不同，芽孢杆菌菌剂基施可减少Cd向水稻秸秆、籽粒中转移，降低植株Cd积累；肠杆菌菌剂基施可增加水稻Cd积累，对植株各部位Cd分配影响较小。

(3) 叶面肥与肠杆菌菌剂联合使用可增强水稻根部对Cd的滞留，减少Cd向地上部转移；与芽孢杆菌菌剂联合使用可大幅降低水稻植株Cd的积累，但存在增加Cd向水稻秸秆及籽粒转移的风险，2种菌剂与叶面肥联合使用对中轻度Cd农田的安全生产有不同的指导意义。