五种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

程汉　吴秋萍　解慧梅

摘要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种严重危害养猪生产的传染病，本项目研究选取了黄芪等5种中药，具有免疫力强，解毒清热等功效，研究这些中药在体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用，筛选出能有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的中药组合配方，为治疗猪繁殖与呼吸综合征提供临床治疗帮助。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征;中药组方;抗病毒;细胞免疫

猪繁殖与呼吸综合征临床上主要以妊娠母猪的早产、流产，产弱仔、死胎和木乃伊胎以及生长猪呼吸道疾病为特征。郭宝清[1] 等于1996年在我国发现该病并分离到病原，此后，猪繁殖与呼吸综合征给养猪业造成的威胁的很大，同时有较大经济损失。当前，该病主要靠预防，还没有防治的有效药物和相关防治办法。近几年，中药受到市场追捧，运用比较普遍，在调整机体阴阳平衡，增强动物机体免疫力，扶正培本等方面具有很好的效果，实验研究证明，许多单味中药和复方药物应用临床，具有抑制病毒感染复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫等功效，同时，中药具有副作用少，药物低残留，药源丰富等优势[2-6] 。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒

Marc-145细胞，由江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制品重点研究室提供，常规培养传代。病毒由江苏农牧学院动物医院鉴定分离。

1.2 主要材料

胰酶细胞消化液，购自上海碧云天生物技术有限公司;胎牛血清、DMEM培养基、噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）均购自上海生工生物工程有限公司。将MTT以无钙离子、镁离子的PBS液配制成5mg/ml，除菌，过滤分装，-20℃避光保存备用。

1.3 药水提取物的制备

将市场采购的黄柏、黄芩、栀子、黄芪和黄连等5种药物，每种药物称4g，用水浸泡1h，小火煎2次，每次煮30min，两次合并，再低速离心，浓缩，定容至20ml。提取后的中药水相当于生药0.2g/ml。用碳酸氫钠溶液调整pH值到7，再经高压蒸汽灭菌，灭菌后分装，-20℃保存备用。

1.4 药物对细胞安全浓度测定

在九十六孔细胞培养板上培养Marc-145细胞长成单层，弃去培养液原液，用PBS洗涤1次。用细胞培养液对各中药原液分别进行2倍倍比稀释至1×2，第1～12孔分别加入100µl，细胞对照孔为第11、12孔，每个稀释度重复4孔，于37℃、5%CO2培养箱中，培养72h，每天定时观察生长情况。72h后倒去培养液，用PBS液洗涤，加入MTT液20µl/孔，37℃继续培养4h后倒去MTT液，加入二甲基亚砜，150µl/孔，振荡10min，等晶体全部溶解，测定OD490nm数值，计算出不同浓度药物的生长抑制率。

1.5 半数病毒组织细胞感染量（TCID50）的测定

参照文献[7-8]，将猪繁殖与呼吸综合征病毒按十倍倍比稀释，在长满细胞的九十六孔细胞培养板上，按100µl/孔的量加入，，最后两列为细胞对照组，各稀释度重复八孔，于37℃、5%CO培养箱中培养1.5h，病毒液除去，各孔加100µlDMEM维持液，再进一步培养。观察病变细胞（CPE）的情况，等72～96h后，用MTT测定法测定各孔OD490nm值，计算出猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的生长抑制率。

1.6 中药体外抗PRRSV效果的测定

参照冼琼珍等[2，7，9]方法，以中药的起始浓度为最大安全浓度，共四个稀释度，用细胞培养液进行两倍稀释中药，每个稀释度重复8孔，猪繁殖与呼吸综合征病毒液的使用稀释度是100TCID50，设立设细胞病毒对照组和对照组。在37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养，注意及时查看CPE的情况，培养72h以后，通过MTT法检测得出各孔OD490nm数值，通过计算得出各中药对感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的Marc-145细胞的保护率。用MTT法检测中药配方组合物的OD490nm数值高，中药的细胞保护率就高，说明它的抑制病毒的吸附能力就越强。

（1）药物的切断作用方法是首先加中草药，其次加入猪繁殖与呼吸综合征病毒，再将中药液加入细胞培养板上，该中药液为安全浓度起始浓度，100µl/孔，37℃培养4h，然后除去中药液，再加入猪繁殖与呼吸综合征病毒液，100µl/孔，于37℃培养2h后除去病毒液，各孔中加入10微升DMEM液。

（2）药物的抑制作用方法是先加猪繁殖与呼吸综合征病毒，再加中草药，在Marc-145细胞上长到单层的九十六孔细胞培养板上加入猪繁殖与呼吸综合征病毒液，100µl/孔，在37℃环境下培养2h后，除去病毒液体，而后加入中药液，此时的中药液浓度为安全浓度，100µl/孔，于37℃下培养，4h后，再除去药液，各孔中加入100µlDMEM维持液。

（3）药物的杀灭作用方法是中药与猪繁殖与呼吸综合征病毒一并加入，制备以药物安全浓度为起始浓度，不同浓度中药培养液倍比稀释，在九十六孔细胞培养板中加入Marc-145细胞，100µl/孔，37℃培养，4h后除去药液，各孔加DMEM维持液100µl。

（4）药物评价及数据处理用SPSS19.0 软件进行统计数据分析，用各中药对细胞保护率来评价效果，如果细胞保护率大就说明药物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用就强。

2 实验结果

2.1 药物对细胞的安全浓度

药物对Marc-145细胞的毒副作用：导致细胞变圆、折光性增加，细胞间黏连和细胞损伤及脱落现象。如果中药液的浓度高，就证明猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞毒性作用就强;如果活的细胞较少，通过MTT法测量，得到的OD值也不高，通常情况下，药物浓度越高，副作用就越大，本实验的结果跟这个规律是符合的。不同浓度下的中药对细胞的生长抑制率，是通过公式以及OD490nm值计算得出的，同时结合CPE的情况，根据以上几种因素，来综合判断中药毒性的强弱。结果说明黄芪的安全浓度最高

（50mg/ml），其他4种中药的最大安全浓度在1.56～3.13mg/ml范围内（如表1所示）。

注：黄连、黄芩起始浓度为50mg/ml，其他药物的起始浓度为100mg/ml。

2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒TCID50的测定

依据Reed-Muench法计算猪繁殖与呼吸综合征病毒的TCID50的结果是1×10-5.393/0.1ml，如果病毒液稀释到1×10-5.393的时候，结果半数的细胞感染。可以看到用不同中药液的稀释后，猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的生长抑制率产生了不同程度的影响，如图表2。

2.3 中药抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果

（1）中药的阻断作用如表3显示，黄芪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的阻断效果最强，黄芪在50～6.25mg/ml浓度下均能100%保护细胞。黄连和黄柏次之，黄连在0.2～1.56mg/ml浓度、黄柏在1.56～3.13mg/ml浓度均能保护50%以上的细胞。黄芩和栀子也有一定的阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附的作用。

（2）中药的抑制作用，由表3可知，5种中药对PRRSV增殖都有一定程度上的抑制作用，黄芪、黄连和栀子的作用最为显著，黄芩其次，中药黄柏的抑制效果最差。

（3）中药的直接杀灭作用，如表3可知，黄芩和黄芪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的杀灭作用非常明显，栀子其次，而黄柏和黄连对PRRSV的直接杀灭作用较低。

從上述可知，五种中药中体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒黄芪效果显著，其他4种中药则在对病毒的阻断、抑制或杀灭作用上均有不同程度的效果。

3 讨论

本试验结果显示黄芪在5种中药中对Marc-145细胞的生长抑制率最低，安全用药的浓度最高，而且在阻断病毒的吸附、抑制病毒的复制和直接杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒方面都表现较强。本实验所选的黄芪等五种中药做了同样的实验，对细胞的毒性程度不同，药物种类不一样，毒性的强弱不一样。在该研究中，当每一种中药液如果稀释至某一个倍数后，几乎不会出现细胞的病理变化。如果所测的药物组OD值相等，或者是测得值大于对照组，这就证明该浓度的中药能引起细胞的生长，同时也证明对细胞是没有毒性的，本实验各中药测定结果与胡元亮[8]等人的研究相符。这些中药之所以对细胞有作用，是因为这些药物中含有很多的活性物质，如多糖类、生物碱类及挥发油类物质等。而药物中的矿物质、氨基酸、维生素、生长因子，与细胞生长和机体免疫力的提高，是密切联系的。药理学研究结果表明，中草药对畜禽病毒性疾病的作用主要体现在直接作用（抗病毒）和间接作用（调节机体免疫功能）2个方面[9]。直接作用体现在一些中药通过阻断病毒增殖过程的吸附、穿入、复制、成熟中的某个环节，从而达到抗病毒的目的[10]。

参考文献

[1] 郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病，1996（2）：3-7.

[2] 冼琼珍，王丙云，丘顺寿，等.10种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究[J].黑龙江畜牧兽医，2014（1）：133-136.

[3] 刘畅，闫艳韬，郎爽，等.中药抗流感病毒研究进展[J].现代中药研究与实践，2018，32（3）：82-86.

[4] 王碧，王晓龙.3个中药方剂对猪瘟治疗效果的评价[J].贵州农业科学，2018，46（5）：80-84.

[5] 马伏英，智光，樊毫军.栀子等中药抑制柯萨奇B3病毒的体外实验研究[J].新乡医学院学报，2006（1）：33-35.

[6] 倪敬轩.中药疫苗稀释剂提高猪伪狂犬和猪瘟弱毒疫苗的免疫效果研究[D].浙江大学，2017.

[7] 冼琼珍，王丙云，伍盛鋆，等.16种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（2）：245-249.

[8] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997.

[9] 刘樱，丁度伟，高求炜，等.3种中药及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究[J].中国畜牧兽医，2016，43（10）：2730-2735.

[10] 袁威，邓穗丹，邓又天，等.中药防制猪繁殖与呼吸综合征的研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（2）：193-197.