鸡屎藤苷酸诱导SGC7901胃癌细胞凋亡并抑制细胞恶性增殖和侵袭

郭强　李井野　王威　兆勇

摘要目的：初步探索雞屎藤苷酸（PA）诱导SGC7901胃癌细胞凋亡并抑制细胞恶性增殖和侵袭的可能机制。方法：选取SGC7901胃癌细胞为研究对象，利用CCK8法进行浓度梯度实验确定后续实验浓度，利用流式细胞术检测0、20、40、80 μg/mL的PA处理后SGC7901胃癌细胞凋亡率以及线粒体膜电位变化情况，BrdU法和Transwell小室实验SGC7901胃癌细胞的增殖活性以及侵袭能力，qRTPCR检测抑癌基因P53、P21的mRNA相对表达水平，Western Blotting检测凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、cMyc和转移相关蛋白VEGF、波形蛋白表达水平。结果：CCK8梯度浓度试验发现PA浓度从40 μg/mL开始对SGC7901胃癌细胞活性产生了明显抑制作用（P<0.05），后续以20、40、80 μg/mL为试验浓度;与0 μg/mL的PA处理比较，40、80 μg/mL的PA处理后SGC7901胃癌细胞凋亡率、Bax/Bcl2、CleavedCaspase3/Caspase3蛋白表达水平以及P53、P21相对表达量升高，线粒体膜电位、细胞增殖活性、侵袭率、cMyc、VEGF、波形蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：PA可能通过降低线粒体膜电位促进线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，促进抗癌基因表达抑制细胞的恶性增殖，并抑制上皮间质转化降低侵袭能力。

关键词胃癌;SGC7901胃癌细胞;鸡屎藤苷酸;恶性增殖;侵袭;转移;凋亡;线粒体膜电位

Paederosidic Acid Induces Apoptosis of Gastric Cancer SGC7901 Cells and Inhibits

Their Malignant Proliferation and Invasion

GUO Qiang，LI Jingye，WANG Wei，ZHAO Yong

（Department of General Surgery，Benxi Central Hospital，Benxi 111027，China）

AbstractObjective：To preliminarily explore the underlying mechanism of paederosidic acid（PA） in inducing the apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells and inhibiting their malignant proliferation and invasion.Methods：The concentration gradient test was conducted on SGC7901 cells by CCK8 to determine the subsequent experimental concentration.The changes in the apoptosis rate of SGC7901 cells and mitochondrial membrane potential（MMP） after PA treatment（0，20，40，and 80 μg/mL） were detected by flow cytometry.The proliferation activity and invasion ability of SGC7901 cells were detected by BrdU staining and Transwell assay.The relative expression levels of tumor suppressor genes（P53 and P21） were detected by qRTPCR.The expression levels of apoptosisrelated proteins（Bcl2，Bax，Caspase3，and cMyc） and metastasisrelated proteins（VEGF and vimentin） were detected by Western blot.Results：As revealed by the CCK8 concentration gradient test，PA at the concentration higher than 40 μg/mL showed inhibitory effects on the activity of SGC7901 cells（P<0.05）.The subsequent experimental concentrations were determined as 20，40，and 80 μg/mL.Compared with the results after PA treatment at 0 μg/mL，the apoptosis rate of SGC7901 cells，protein expression levels of Bax/Bcl2 and cleavedCaspase3/Caspase3，and relative mRNA expression levels of P53 and P21 increased，while MMP，cell proliferation activity，invasion rate，and protein expression levels of cMyc，VEGF，and vimentin decreased after PA treatment at 40 and 80 μg/mL（P<0.05）.Conclusion：PA may induce cell apoptosis by reducing MMP and promoting mitochondrial apoptosis pathway to promote the expression of antioncogenes，inhibit malignant proliferation and epithelialmesenchymal transition，and reduce the invasion ability.

KeywordsGastric cancer; SGC7901; Paederosidic acid; Malignant proliferation; Invasion; Metastasis; Apoptosis; Mitochondrial membrane potential

中图分类号：R273;R735.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.008

胃癌是一类常见的消化系统恶性肿瘤，多以腺癌为主，根据世界卫生组织统计结果显示，亚洲范围内胃癌的发病率占据全球恶性肿瘤发生率的第7位，死亡率在10%左右[12]，在我国胃癌的发病率仅次于第1位的肺癌，同时胃癌死亡率在所有恶性肿瘤中排在第3位[3]。化疗作为晚期胃癌患者的主要治疗方式之一，通常会伴随较为严重的不良反应，而对于多重耐药的GC患者而言，化疗的临床受益极低[4]，因此寻找治疗胃癌的新方法具有重要的意义。几千年来，中医药在人类健康的许多领域都取得了瞩目的成就，得到全世界的认可。鸡屎藤Paederiascandens（Lour.）Merrill.是我国少数民族中比较常用的一味民间药，其分布较广，大部分分布于亚洲热带地区，具有较好的抗炎、镇痛、抑菌的功效[5]，并且其环烯醚萜苷类成分提取物已被证实有较好的抗肿瘤活性[6]。但环烯醚萜苷类成分因为提取的方式不同，其种类也有较大的区别，因此具体是哪种成分发挥抗癌作用尚不清楚。本研究以SGC7901胃癌细胞为研究对象，旨在探索鸡屎藤苷酸（Paederosidic Acid，PA）对SGC7901胃癌细胞凋亡、增殖以及侵袭的可能机制，为鸡屎藤的开发利用提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞将已复苏的GC7901胃癌细胞（购自中科院上海细胞库）培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的完全RPMI 1640培养液培养，并在37 ℃、5% CO2的加湿培养箱中培养，每2～3 d更换肿瘤细胞培养液，待细胞生长至对数期，采用0.25%胰蛋白酶消化液处理制成细胞悬液，计数后用于后续相关研究。

1.1.2药物鸡屎藤苷酸（Paederosidic Acid，PA，上海源叶生物技术有限公司，货号：B20585）。

1.1.3试剂与仪器RPMI1640培养基、10%胎牛血清（Gibco公司，美国，货号：23400021，10091148）;总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒（赛默飞世尔科技公司，货号：AM1931、4368813、12574030）;CCK8试剂盒（日本同仁，日本，货号：VC5001）;Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20190825）;JC1试剂盒（南京生兴生物有限公司，批号：190714）;P53、P21及内参基因β肌动蛋白引物（上海生工生物工程股份有限公司，批號：191108、191025、191104）;兔抗人Bcl2、Bax、CleavedCaspase3、Caspase3、cMyc、VEGF、波形蛋白、GAPDH单克隆抗体（赛默飞世尔科技公司，货号：14102882、336400、PA5114687、MA511521、MA1980、MA513182、MA511883、MA116757）;流式细胞仪（BD公司，美国，型号：BDFACSCalibur）;实时荧光定量PCR仪（罗氏，德国，型号：Roche LightCycler96）;正置荧光显微镜（NiKON，日本，型号：NiKON ECLIPSE TE2000S）。离心机（Select BioProducts公司，美国，型号：Selectspin 17R）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备

1.2.1.1CCK8法检测细胞活性对照组：GC7901胃癌细胞（未加入PA）;观察组：GC7901胃癌细胞+不同浓度PA（1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）。

1.2.1.2流式细胞检测细胞凋亡对照组：GC7901胃癌细胞（未加入PA）;观察组：GC7901胃癌细胞不同浓度PA（根据CCK8最终结果筛选出实验浓度，PA浓度终浓度设置为20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.3JC1试剂盒检测细胞膜电位变化情况对照组：GC7901胃癌细胞（未加入PA）;观察组：GC7901胃癌细胞不同浓度PA（根据CCK8最终结果筛选出实验浓度，PA浓度终浓度设置为20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.4BrdU法检测细胞增殖情况对照组：GC7901胃癌细胞（未加入PA）;观察组：GC7901胃癌细胞不同浓度PA（根据CCK8最终结果筛选出实验浓度，PA浓度终浓度设置为20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.5Transwell小室试验检测细胞侵袭情况对照组：GC7901胃癌细胞（未加入PA）;观察组：GC7901胃癌细胞不同浓度PA（根据CCK8最终结果筛选出实验浓度，PA浓度终浓度设置为20、40、80 μg/mL）。

1.2.2给药方法

1.2.2.1CCK8法检测PA对GC7901胃癌细胞生长的影响对照组：未加入PA;观察组：PA终浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL。

1.2.2.2流式细胞术检测不同浓度PA对GC7901胃癌细胞凋亡的影响对照组：未加入PA;观察组：PA终浓度分别为20、40、80 μg/mL。

1.2.2.3JC1试剂盒检测不同浓度PA对GC7901胃癌细胞膜电位变化的影响对照组：未加入PA;观察组：PA终浓度分别为20、40、80 μg/mL。

1.2.2.4BrdU法检测不同浓度PA对GC7901胃癌细胞增殖的影响对照组：未加入PA;观察组：PA终浓度分别为20、40、80 μg/mL。

1.2.2.5Transwell小室试验检测不同浓度PA对GC7901胃癌细胞侵袭的影响对照组：未加入PA;观察组：PA终浓度分别为20、40、80 μg/mL。

1.2.3检测指标与方法

1.2.3.1PA对GC7901胃癌细胞增殖影响的检测增殖率、CCK8法、BrdU法。具体如下：CCK8法：将培养好的GC7901胃癌细胞分为10组，分别加入0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL的PA后，调整细胞数目为2×107个/L，接种至96孔板上，每个浓度6个复孔，在接种后向每孔滴加10 μL配好的CCK8溶液，继续培养24 h后，用酶标仪检测各孔的吸光度（OD）值，计算不同剂量PA处理后细胞成活分数，成活分数=处理组OD值/空白对照组OD值;BrdU法：将培养好GC7901胃癌细胞悬浮后，加入生理盐水调整浓度为5×103/mL接种于96孔板、200 μL/孔，每组3个复孔，预培养12 h，加入0、20、40、80 μg/mL的PA处理48 h后，弃培养液，加入10 μmol/L BrdU继续孵育24 h，弃培养液，4%多聚甲醛孵育30 min，100 μL过氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗体1 h，PBS清洗3次，加入四甲基联苯胺染色30 min，于荧光显微镜下观察各组细胞阳性数目。

1.2.3.2PA对GC7901胃癌细胞凋亡影响的检测细胞凋亡率，流式细胞术。具体操作如下：将培养好的GC7901胃癌细胞调整为4×104个/mL，接种于6孔板中、400 μL/孔，每组3个复孔，加入0、20、40、80 μg/mL的PA处理，培养48 h后收集各组细胞，166.5×g离心5 min，PBS洗涤2遍，弃上清液，加入Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒中的缓冲液，混匀，再加入5 μL AnnexinV/FITC、10 μL PI混合，室温避光孵育15 min，流式细胞仪上样检测，后采用CellQuest软件分析计算细胞凋亡率。

1.2.3.3PA对GC7901胃癌细胞膜电位变化影响的检测红绿荧光信号比例，JC1法。具体如下：将培养好GC7901胃癌细胞悬浮后，加入生理盐水调整浓度为2×106/mL，添加到6孔板上，分别加入0、20、40、80 μg/mL的PA处理，培养48 h后，加入1 mL JC1工作液，混合均匀后37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育20 min，并将JC1染色缓冲液按1∶5的比例稀释，孵育结束后，吸去上清，用稀释后的JC1缓冲液清洗3次后，加入流式细胞测试缓冲液后上机，以红绿荧光信号比例表示线粒体膜电位情况。

1.2.3.4PA对GC7901胃癌细胞中P53、P21相对表达量的检测相对表达量，实时PCR。具体如下：按照总RNA提取试剂盒说明书上操作步骤提取0、20、40、80 μg/mL的PA处理48 h后GC7901中的总RNA，凝胶电泳检测RNA的完整性，并用紫外分光光度计检测RNA质量;反转录试剂盒说明书将符合标准的RNA反转为cDNA。反转录体系（10 μL）：2×miRNA反应混合液5 μL，0.1% BSA 1 μL，miRNA PrimeScript RT酶混合物1 μL，总RNA 0.5 μL，去RNA酶去离子水（ddH2O） 2.5 μL。反应条件设置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。PCR体系10 μL：SYBR Prmix Ex Tap Ⅱ（2×）5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。详细操作见试剂盒说明书。PCR参数設置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每个样孔设置3个复孔。用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.2.3.5PA对GC7901胃癌细胞侵袭率影响的检测穿膜细胞数，Transwell小室试验。具体如下：将铺有Matrigel胶的Transwell小室预热至37 ℃后，用无血清培养液洗涤细胞3次后重悬细胞，分别加入0、20、40、80 μg/mL的PA后，调整细胞密度至1×105个/mL，在Transwell下室放入1 mL含10%胎牛血清的培养液，上室加入300 μL细胞悬液后培养36 h。取出小室，利用棉签轻柔地擦去上层未穿膜的细胞和基质胶，用冰甲醛对滤膜进行固定后结晶紫染色。将滤膜剥离后正面朝下固定在载玻片上，在光学显微镜下随机选择5个高倍镜（×400）下视野进行细胞计数，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。

1.2.3.6PA对GC7901胃癌细胞中凋亡及侵袭相关蛋白表达量的检测蛋白相对表达量，Western blotting法。具体如下：提取0、20、40、80 μg/mL的PA处理48 h后GC7901胃癌细胞中总蛋白，利用BCA法进行蛋白定量，并利用Bradford调整各组蛋白浓度一致，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转膜至甲醛处理过预处理过的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，密封2 h，加入兔抗人Bcl2、Bax、CleavedCaspase3、Caspase3、cMyc、VEGF、波形蛋白、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBST漂洗40 min，加入HRP标记的二抗（1∶500）孵育1 h，PBST漂洗40 min，ECL发光液将PVDF膜显色，暗室曝光到X线片上，采用Image J软件分析各组条带灰度值。

1.3统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，假设检验的标尺以α=0.05加以比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PA对SGC7901胃癌细胞增殖活性的影响随着PA处理浓度的升高，SGC7901胃癌细胞的增殖活性也随之降低，当处理浓度为40 μg/mL时，增殖活性的降低差异有统计学意义（P<0.05），因此后续试验选择20、40、80 μg/mL作为处理浓度。见图1。

2.2PA对SGC7901胃癌细胞凋亡的影响与0 μg/mL PA处理比较，20 μg/mL PA干预时SGC7901胃癌细胞的凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），40、80 μg/mL PA处理后SGC7901细胞的凋亡率显著升高（P<0.05）。见图2。

2.3PA对SGC7901胃癌细胞线粒体膜电位的影响与0 μg/mL PA处理比较，20 μg/mL PA干预时SGC7901胃癌细胞中JC1红绿信号比率差异无统计学意义（P>0.05），40、80 μg/mL PA处理后SGC7901胃癌细胞中JC1红绿信号比率明显降低（P<0.05）。见图3。

2.4PA对SGC7901胃癌细胞恶性增殖的影响与0 μg/mL PA处理比较，20 μg/mL PA干预时SGC7901胃癌细胞内BrdU染色阳性率差异无统计学意义（P>0.05），40、80 μg/mL PA处理后SGC7901胃癌细胞内BrdU染色阳性率明显降低（P<0.05）。见图4。

2.5PA对SGC7901胃癌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响与0 μg/mL PA处理比较，20 μg/mL PA干预时SGC7901胃癌细胞中Bax/Bcl2比值明显升高（P<0.05），cMyc表达水平明显降低（P<0.05），

ClaevedCaspase3/Caspase3比值差異无统计学意义（P>0.05）;40、80 μg/mL PA处理后SGC7901胃癌细胞中Bax/Bcl2、ClaevedCaspase3/Caspase3比值明显升高（P<0.05），cMyc表达水平明显降低（P<0.05）。见图5。

2.6PA对SGC7901胃癌细胞中P53、P21相对表达水平的影响与0 μg/mL PA处理比较，20 μg/mL PA干预时SGC7901胃癌细胞内P53、P21相对表达水平差异无统计学意义（P>0.05），40、80 μg/mL PA处理后SGC7901胃癌细胞内P53、P21相对表达水平明显升高（P<0.05）。见图6。

2.7PA对SGC7901胃癌细胞侵袭能力及相关蛋白表达的影响与0 μg/mL PA处理比较，20 μg/mL PA干预时SGC7901胃癌细胞内侵袭细胞数、VEGF、波形蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），40、80 μg/mL PA处理后SGC7901胃癌细胞内侵袭细胞数、VEGF、波形蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图7。

3讨论

鸡屎藤作为我国传统草药在历代本草著作中均有记载，主治风湿痹病、脘腹疼痛等，且目前已有全草的提取制剂用于临床[7]。随着近年来国内外对鸡屎藤化学组分和药理活性研究的不断深入，其抗炎、镇痛、抑菌、影响胃肠道功能以及抗肿瘤等生物活性被不断发现，并且有研究通过连续给小鼠注射鸡矢藤注射液后未见小鼠活动及脏器的异常，可见其安全性较高、毒性小[8]。PA作为一类从鸡屎藤中提取主要的环烯醚萜苷类成分，目前尚未有其抗肿瘤活性的相关报道。本研究结果显示，随着PA处理浓度的升高，其对SGC7901胃癌细胞系增殖活性的抑制逐渐增强，并且在40 μg/mL时差异有统计学意义，提示PA具有抑制肿瘤增殖的作用，并呈浓度依赖。同时李红霞等[6]研究证实鸡屎藤环烯醚萜苷提取物在500 μg/mL剂量及之下时对细胞无毒性作用，进一步证实了PA具有独特的抗肿瘤作用。为了进一步研究PA抗肿瘤的可能机制，本研究选择20、40、80 μg/mL为实验浓度。

细胞凋亡作为维持机体稳态的重要调控方式，诱导肿瘤细胞凋亡是多种抗癌药物靶向的关键机制[9]。本研究通过流式细胞术发现，随着PA处理浓度的提高，SGC7901胃癌细胞的细胞凋亡率明显升高，并且JC1的红绿信号比率明显降低。JC1作为检测线粒体膜电位的理想荧光探针，当线粒体膜电位较高时，其聚集在线粒体基质中，形成聚合物产生红色荧光，而线粒体膜电位降低时，JC1以单体形式存在，发出绿色荧光，因此绿色荧光的增多提示线粒体膜电位下降，而这一现象是细胞凋亡早期的标志性事件[10]。Bcl2和Bax蛋白是Bcl2蛋白家族的主要蛋白，由于该家族蛋白的主要位点分布在线粒体膜上，因此主要调控线粒体凋亡途径[11]。Bcl2和Bax蛋白作为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。大多数恶性肿瘤中，Bcl2的表达升高，而Bax的表达降低[12]，但PA处理后，SGC7901胃癌细胞中Bax/Bcl2比值明显升高，提示PA可能通过下调抗凋亡蛋白，上调促凋亡蛋白表达从而诱导细胞凋亡。Caspases3是Caspases家族诱导细胞凋亡中最关键的效应蛋白，在整个细胞凋亡通路中最终都是由Caspases3来行使凋亡功能，因此Caspases3水平与细胞凋亡关系密切[13]。cMyc作为一类与肿瘤细胞无限增殖和增殖后结局密切相关的蛋白，与肿瘤的恶性程度显著相关[14]。本研究结果显示，随PA处理浓度的升高，SGC7901胃癌细胞中具有活性的Caspases3表达水平明显升高，而cMyc蛋白表达水平明显降低，表明PA能够调节细胞增殖促进细胞凋亡。BrdU荧光染色结果显示，随PA处理浓度的升高，BrdU染色阳性率明显降低，也进一步证实了PA对SGC7901胃癌细胞恶性增殖能力的抑制效果。P53基因是体内非常重要的抑癌基因，能够介导多种信号转导途径[15]，使细胞分化停留在G1检验点，诱导细胞凋亡，避免细胞到下一代时发生DNA突变，而发生癌变[16];P21则是细胞周蛋白依赖性激酶抑制因子家族中的重要成员，其编码的蛋白富含精氨酸，能够抑制细胞周蛋白依赖性激酶和增殖细胞核抗原的表达，而参与细胞DNA损伤修复[17]。本研究中PA处理后，SGC7901胃癌细胞中P53、P21的相对表达水平均明显升高，提示PA可能是通过调控细胞周期的过程，来抑制癌细胞的恶性增殖。

侵袭、转移作为恶性肿瘤的重要生物学特征。本研究通过Transwell试验发现，随着PA处理浓度的升高，SGC7901胃癌细胞穿膜细胞数明显降低，提示PA处理抑制了SGC7901胃癌细胞的侵袭能力。恶性肿瘤的生长和转移依赖于血管的生成，VEGF作为一种血管生长因子，能够促进肿瘤血管内皮细胞的生长[18]，还能增加血管的通透性，导致周围组织的纤维蛋白沉积，有利于肿瘤基质的形成及对新生血管的浸润，从而增强肿瘤的转移能力[19]。波形蛋白是一种中间丝蛋白，在体内发挥着连接细胞膜和核膜的作用，在间叶组织细胞中表达，是上皮间质转化的重要因子，在大多数肿瘤细胞中尤其是低分化癌中表达量显著升高，是判断肿瘤细胞是否转移的重要指标之一[20]。本研究发现，PA处理后，SGC7901胃癌细胞中VEGF、波形蛋白的表达水平均明显降低，表明PA可能通过抑制VEGF、波形蛋白表达进而抑制了SGC7901胃癌细胞的侵袭能力。

综上所述，PA作为中药鸡屎藤的主要活性成分之一，能够诱导线粒体膜电位降低，从而激活线粒体凋亡途径相关蛋白表达，进而诱导细胞凋亡;同时还能够上调促进抗癌基因表达抑或终止细胞周期而抑制癌细胞的恶性增殖，并且还能够抑制侵袭相关蛋白的表达，而降低侵袭能力。但本研究只是初步探索了PA调控胃癌细胞的增殖作用，其具体的调控机制以及是否在体内依然有效还有待进一步研究。

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（2020-09-01收稿本文編辑：杨燕）文献研究

基金项目：辽宁省自然科学基金计划项目（2017020388）

作者简介：郭强（1981.02—），男，硕士，副主任医师，研究方向：胃肠肿瘤，肝胆胰腺肿，Email：guoqiang198102@163.com