7种杀菌剂和5种植物抗病激活剂对油茶炭疽病病菌活性研究

王翠兰，左璐莹，张绍勇，陈安良*

(1.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300；2.湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 313000)

油茶(Camelliaoleifera)山茶科属，是世界四大木本油料植物之一，中国特有的油料植物[1-2]。茶油既可用于食用，也可用于工业，茶籽饼不仅可用于生产洗净剂及动物饲料，也是有机肥的重要原料，其产品链的延伸，可有效带动山区经济发展，具有较好的经济价值[3-4]。

胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是目前引起油茶炭疽病的主要病原菌，主要危害油茶叶片及果实，严重时可造成大面积落叶、落果、落蕾，甚至整株枯死[5]。病果产油量仅为健康果的50%，炭疽病重灾区油茶减产高达40%～50%，经济损失严重[6]。

目前，国内有关胶孢炭疽病菌的防治研究多数局限于杀菌剂筛选，通过轮换杀菌剂，减缓其抗药性的发生。杀菌剂通过直接抑制病原菌的生长，具有毒杀性，频繁使用即污染环境，食品安全也受威胁。同时，病害防治是以防重于治的原则，因此很有必要研究开发新型药剂。植物抗病激活剂是新型农药重要的发展方向，与传统农药相比，可激活植物免疫系统，调节植物新陈代谢，进而提高植物抗病和抗逆能力[7]，诱导植物对多种病害产生抗性，且对环境安全友好。自Asai等[8]研究发现植物自身存在保护机制，可抵御细菌及霉菌的侵染，至今已有不少相关研究报道，如W.S.Park等[9]确定了水杨酸甲酯是植物免疫响应过程中的关键信号；李天来等[10]研究发现茉莉酸甲酯+Ca处理番茄幼苗可显著降低灰霉病的发病率；张穗[11]研究发现，使用井岗霉素处理水稻后，植株对水稻纹枯病菌的控制效果明显，程小龙[12]则发现在烟草植株上，0.5 mg/L水杨酸对烟草青枯病诱抗效果最好。关于油茶炭疽病的防治虽有不少报道，但以杀菌剂和植物抗病激活剂为主，进行系统筛选的研究较少。本研究旨在筛选出可诱导油茶产生高效抗病性的植物抗病激活剂，和高活性杀菌剂配合使用，以期研发出对油茶炭疽病高效、长效的混配剂及其防治方法，从而减少杀菌剂的用量，提高油茶产品的安全性。为油茶林间绿色防治提供新思路、新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油茶由建德市欣林林木服务中心提供，为2年生盆栽苗。供试菌株胶孢炭疽菌由浙江农林大学森林保护学科绿色农药2011协同创新中心菌种储存室提供。杀菌剂：98%咪鲜胺(prochloraz)粉剂、98%多菌灵(carbendazim)粉剂、99%戊唑醇(tebuconazole)粉剂、95%甲基托布津(thiophanate-methyl)粉剂、60%啶氧菌酯(tebuconazole)粉剂、99%嘧菌酯(azoxystrobin)粉剂、98%百菌清(prochloraz)粉剂，均购于上海源叶生物有限公司；植物抗病激活剂：99.5%水杨酸(salicylic acid，SA)粉剂、95%井岗霉素(validamycin)粉剂、95%茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)水剂、95%芸苔素内酯(brassinolide)粉剂、98% 2,1,3-苯并噻二唑(2,1,3-Benzothiadiazole)粉剂，均购于阿拉丁试剂有限公司。

1.2 杀菌剂对油茶炭疽病病菌的室内毒力测定

1.2.1 对菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法。以预试验结果为依据，将咪鲜胺、多菌灵配置为2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L；甲基托布津、戊唑醇、啶氧菌酯、嘧菌酯、百菌清分别配置为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L。再在超净工作台中，将药剂与融化的PDA培养基按1∶9比例混合，制备含毒培养基。将供试菌株接种于经高温灭菌的PDA平板上，于25 ℃、黑暗条件下培养5 d，用灭菌打孔器取直径5 mm菌饼，接种于各处理下含毒培养基上，每处理3重复，以同体积不含药培养基为对照，25 ℃恒温培养。5 d后采用十字交叉法测量菌丝生长直径，计算菌丝生长的抑制率。

抑菌率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100

(1)

1.3 植物抗病激活剂活性测定方法

1.3.1 对菌丝生长的抑制作用 与1.2.1方法相同。

1.3.2 活体测定法 根据预试验，水杨酸、井冈霉素配制质量浓度为200、100、50 mg/L；茉莉酸甲酯、芸苔素内酯及2,1,3-苯并噻二唑配制质量浓度为100、50、25 mg/L。分别将不同浓度的诱抗剂喷洒于长势良好且大小一致的2年生油茶苗上，喷至叶片完全润湿即可，2 d后再重复喷洒1次，再过5 d后从油茶植株上采摘叶片，以刚成熟的黄绿色嫩叶为宜，使用对叶片接种针进行刺伤，不宜刺穿叶片，最后将孢子悬浮液(103～106个/mL)用灭菌毛笔涂抹接种，然后置于带有湿润无菌滤纸的培养皿内，黑暗条件25 ℃恒温保湿培养，每个处理3株，每株采集4片叶，以无菌水做空白对照。7 d后采用网格法，测量各叶片的病斑扩展面积，以病斑减小率表示各药剂的诱抗效果。

病斑减小率/%=对照处理病斑面积-诱导处理病斑面积/对照处理病斑面积×100

(2)

1.4 数据处理

使用Excel将原始数据进行整理，计算各药剂的不同浓度处理后菌丝抑制率，通过SPSS version22 Probit分析，得到其线性回归方程及EC50。植物抗病激活剂活体筛选试验的结果，分别进行方差分析及显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对菌丝生长的抑制作用

在各供试浓度条件下，7种杀菌剂对油茶炭疽病菌菌丝生长均有一定的抑制作用。由表1可知，咪鲜胺对其病原菌的生物活性最强，EC50为0.129 mg/L；其次为多菌灵，EC50为0.229 mg/L；而甲基托布津、戊唑醇、啶氧菌酯、嘧菌酯、百菌清对其生物活性相对较低，EC50分别为0.771、3.11、21.937、28.666、52.110 mg/L。因此，7种杀菌剂中，咪鲜胺对油茶炭疽病菌菌丝生长的抑制活性更佳。

表1 7种供试杀菌剂对胶孢炭疽菌丝生长的抑制作用

2.2 植物抗病激活剂对油茶炭疽菌的活性测定

2.2.1 对菌丝生长的影响 采用菌丝生长速率法测定了5种植物抗病激活剂的活性。含诱抗剂的PDA平板与对照相比，病原菌的菌落形状，生长速度及颜色等外观特征均无明显差异。各处理下菌丝生长直径与对照相比差异性均未达到显著水平。高浓度处理的各个诱抗剂对其菌丝生长略有些抑制作用。

2.2.2 5种植物抗病激活剂对油茶的诱抗效果 通过对油茶进行活体喷药后，5种植物抗病激活剂在不同浓度处理下对油茶炭疽病均具有一定的诱抗效果。其中水杨酸，芸苔素内酯及茉莉酸甲酯在各处理下均具有较好的诱抗效果，最高诱抗效果依次为50.13%、36.82%、26.93%；其他2种诱抗剂井岗霉素和苯并噻二唑最高诱抗效果仅为19.67%和17.73%，两者诱抗效果相当，均较差。5种植物抗病激活剂在各浓度处理下，以水杨酸处理的诱抗效果最佳，最适诱导质量浓度为100 mg/L。

表2 5种植物抗病激活剂对油茶叶片病斑扩展的影响

3 结论与讨论

本研究分别测定了7种杀菌剂和5种植物抗病激活剂对胶孢炭疽菌的活性，供试杀菌剂中咪鲜胺、多菌灵、甲基托布津、戊唑醇均有较好的抑制作用，其中咪鲜胺抑菌效果最佳，啶氧菌酯、百菌清、嘧菌酯抑菌效果均较差。油茶通过5种植物抗病激活剂处理后，对胶孢炭疽病菌的诱抗效果均不同，初步确定最适诱抗剂为水杨酸，最佳防治质量浓度为100 mg/L，诱抗效果达50.13%，本研究中杀菌剂室内毒力测定结果与前人研究成果类似[13]。咪鲜胺DMIs类杀菌剂可抑制真菌中麦角甾醇生物合成途径中关键酶 CYP51 的合成，阻碍麦角甾醇的合成，导致真菌细胞膜结构破坏和细胞死亡，兼具内吸和保护作用[14-15]。啶氧菌酯与嘧菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂可抑制真菌线粒体呼吸，主要表现对孢子生长的抑制作用[15]。因此在此试验中活性较其他几种的抑菌活性差。油茶诱导抗性结果与王宏虬等人研究马铃薯对疮痂病诱抗筛选一致[16]，以及与王军等[17]、李姝江等[18]采用SA诱导茶树产生抗性研究结果相似。

植物抗病激活剂可显著提高植物的免疫防御能力，诱导植物产生广谱的抗病性，从而使植物抵御病原菌的侵害[19]。目前，关于水杨酸诱导植物产生抗性的研究，多数集中在农作物上，如SA诱导水稻幼苗抗白叶枯病(Xanthomonasoryzae)的最适诱导质量浓度为5～50 μg/mL[20]；M.Kubota等[21]研究发现SA可诱导黄瓜对炭疽病产生抗性；张莹等[22]发现SA可诱导玉米产生对玉米大斑病(Exserohilumturcicum)的抗性作用；而木本植物的研究报道鲜少。本次试验在已广泛研究的杀菌剂基础上，增加植物抗病激活剂对油茶诱导抗性的活性测定，研究结果以期为研发杀菌剂和植物抗病激活剂混剂，用于防治油茶炭疽病提供一定的参考价值，同时，为油茶炭疽病防治中的“减药增效”提供新方法。