节瓜CqWRKY31的互作蛋白筛选与鉴定

闫晋强 王 敏 彭庆务 刘文睿 江 彪 谢大森 何晓明*

（1 广东省农业科学院蔬菜研究所，广东广州 510640；2 广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东广州 510640）

节 瓜（Cogn.var.-How.）是葫芦科冬瓜属冬瓜种的变种，是我国岭南地区特产蔬菜，在广东、广西、海南等地普遍栽培，产品除供应本地市场，还大量外销港澳和东南亚等地区（谢大森 等，2006；康德贤 等，2013）。由尖孢镰孢菌（）引起的枯萎病是节瓜生产中的主要病害，严重影响节瓜的产量和商品性。由于节瓜资源相对较少，遗传背景狭窄，缺乏枯萎病抗性材料。镰刀菌酸（fusaric acid，FA）是尖孢镰孢菌代谢过程分泌的毒素（Kuo &Scheffer，1964），是引起枯萎病的重要致病因子（蒋荷 等，2013）。何晓明等（2009）利用FA 胁迫节瓜不定芽获得抗FA 再生植株，这些FA 抗性材料同样具有枯萎病抗性。通过现代生物技术手段获得抗性材料，明确抗性材料的抗病机理对节瓜枯萎病抗性育种具有重要意义。

WRKY 转录因子是最大的基因家族之一，容易受到外界环境的刺激诱导表达，广泛参与植物响应生物与非生物胁迫多个过程（Jiang et al.，2017）。例如，通过转录组分析大豆感染锈病不同时间的基因表达差异，发现16 个WRKY 转录因子在锈病感染前后表达变化显著（Bencke-Malato et al.，2014），表明这些WRKY 转录因子可能调控大豆锈病抗性水平。盐、HS 和HO胁迫葡萄后，葡萄VvWRKY30 诱导表达，异源过表达VvWRKY30 可以提高拟南芥的抗氧化酶活性和抗盐水平（Zhu et al.，2019）。白杨PalWRKY77 通过抑制ABA 信号途径相关基因的表达，降低白杨耐盐性（Jiang et al.，2021）；WRKY 转录因子同样参与尖孢镰孢菌引起的植物枯萎病调控。番茄专化型尖孢镰孢菌侵染番茄后，通过分析不同WRKY 转录因子的时空表达，发现16 个WRKY转录因子与枯萎病侵染相关，其中SlWRKY33 和SlWRKY37 上调表达，SlWRKY4 下调表达（Aamir et al.，2018）。尖孢镰孢菌侵染棉花、西瓜等作物后，相关WRKY 转录因子的表达水平也发生显著变化（Guo et al.，2011；Yang et al.，2014）。尖孢镰孢菌侵染岷江百合后，一些WRKY 转录因子表达发生变化，其中LrWRKY1 上调表达，过表达LrWRKY1 可以提高岷江百合枯萎病抗性水平（Li et al.，2021）。

酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。目前为止，已在小麦（魏春茹 等，2020）、水稻（孔兰 等，2019）、番茄（赵怀印 等，2020）以及草莓（李小龙 等，2019）等多种作物中通过酵母双杂交技术成功筛选某一基因或者转录因子的互作蛋白，为进行相关基因功能研究奠定了理论基础。笔者前期研究发现，节瓜抗性材料A39FA 中CqWRKY31 受FA 诱导表达，为节瓜响应FA 胁迫的正调控因子（Mao et al.，2017）。目前为止，CqWRKY31 调控节瓜枯萎病（或FA）的抗性机制尚未解析，发掘CqWRKY31 的互作蛋白，解析互作蛋白的功能特点，对研究CqWRKY31 的调控机制具有重要意义。因此，本试验通过酵母双杂技术，筛选CqWRKY31 的互作蛋白，为进一步研究CqWRKY31 响应FA 胁迫和尖孢镰孢菌侵染的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用酵母文库为广东省蔬菜新技术研究重点实验室保存的以冬瓜B227 根、茎、叶、花、幼果为材料构建的cDNA 均一化酵母文库（陈凤 等，2021）。冬瓜自交系B227 于2019 年春季种植在广东省农业科学院白云试验基地，在坐果期采取不同组织材料后放置液氮中速冻，于-80 ℃超低温冰箱保存备用。节瓜抗枯萎病自交系A39 的CqWRKY31 CDS 序列通过全基因合成。

1.2 诱饵载体构建

将全基因合成的CqWRKY31 连接到pGBKT7载体得到pGBKT7-CqWRKY31。以pGBKT7-WRKY31 载体为模板，PCR 扩增WRKY31-1（引物WRKY31-1-F 和WRKY31-1-R）和WRKY31-2（引物WRKY31-2-F 和WRKY31-2-R），引物信息见表1。PCR 产物和pGBKT7 载体分别经RI 和HI 双酶切、纯化后进行载体和目的片段连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，将转化出来的单菌落阳性检测后测序验证。

表1 引物信息

1.3 目的蛋白毒性和自激活活性检测

目的基因诱饵载体pGBKT7-CqWRKY31/pGADT7 AD、pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD空载体分别以醋酸锂（LiAc）法共转Y2H gold（MATα）菌株，涂布SD/-Leu/-Trp 平板。挑取SD/-Leu/-Trp平板上生长较好的单克隆（一般直径＞2 mm）到SD/-Leu/-Trp 液体培养基中，摇至对数生长期（29 ℃、200 r·min、200 h），点板到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板。结果判断标准如下：若在SD/-Leu/-Trp 平板和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上都无菌斑，表明目的蛋白有毒性；若在SD/-Leu/-Trp平板和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上都有菌斑，表明目的蛋白有自激活；在SD/-Leu/-Trp 平板上有白色菌斑，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上无菌斑，表明目的蛋白无自激活。

1.4 CqWRKY31 互作蛋白筛选

将无毒性、无自激活的载体LiAc 法转Y2H gold 菌株，涂布SD/-Trp 平板。从SD/-Trp 平板上挑取直径2～3 mm、携带诱饵质粒的Y2H gold 单克隆，接入50 mL SD/-Trp 液体培养基中过夜培养，取适量过夜菌液接种于YPDA 培养基（YPD培养基基础上加入0.003%腺嘌呤硫酸盐）中培养至OD为0.4～0.6。以PEG/LiAc 法将文库DNA转化包含诱饵载体的酵母，涂布于SD/-Leu/-Trp二缺平板，选取菌斑大于2 mm 的菌落，打点至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 四缺平板，2～3 d 后长出的菌落挑出来做插入片段扩增，所用引物5′LD Amplimer 和3′LD Amplimer，序列信息见表1，经PCR 扩增检测阳性的菌落进行测序分析。

1.5 阳性克隆的回复杂交验证

挑取阳性克隆培养后抽提质粒，将质粒转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，挑取单克隆培养，抽提质粒。取质粒和pGBKT-WRKY31-1 质粒共转Y2H gold 酵母感受态细胞，涂布SD/-Leu/-Trp 二缺平板，培养3～5 d 后拍照。二缺平板长出的单克隆，涂布SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和加有x-α-gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 四缺平板，5～14 d 后拍照。

2 结果与分析

2.1 CqWRKY31 诱饵载体的构建和自激活检测

首先，通过全基因合成将节瓜CqWRKY31 连接到pGBKT7 载体，构建pGBKT7-CqWRKY31 载体。pGBKT7-CqWRKY31 经RI和HI双酶切，产生1 098 bp 大小的目的片段条带和7 294 bp 大小的线性化载体条带，琼脂糖凝胶电泳检测（图1）与预期相符，经进一步测序验证，确定载体正确。将pGBKT7-CqWRKY31/pGADT7 AD 空载体以LiAc 法共转Y2H gold（MATα）菌株，涂布SD/-Leu/-Trp 平板，平板上无菌斑，表明pGBKT7-CqWRKY31 有毒，无法用来筛库。

图1 ECORI 和BamHI 对pGBKT7-CqWRKY31 载体双酶切

截短后分别构建pGBKT7-CqWRKY31-1和pGBKT7-CqWRKY31-2，经测序无误后，pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 空载体和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD 空载体分别以LiAc 法共转Y2H gold（MATα）菌株，涂布SD/-Leu/-Trp 平板。挑取SD/-Leu/-Trp 平板上生长较好的单克隆（一般直径＞2 mm），挑到SD/-Leu/-Trp 液体培养基中，摇至对数生长期，点板到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板。转化阳性对照、阴性对照、pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 载体和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD 的菌株都可以在SD/-Leu/-Trp 平板上生长，表明pGBKT7-CqWRKY31-1 和pGBKT7-CqWRKY31-2无毒（图2）。转化阳性对照和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD 载体的菌株可以但转化阴性对照和pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 的菌株不可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上生长，表明pGBKT7-CqWRKY31-2 表达的融合蛋白有自激活，pGBKT7-CqWRKY31-1 表达的融合蛋白无自激活（图2），pGBKT7-CqWRKY31-1 可用于后续筛库。

图2 pGBKT7-CqWRKY31-1 和pGBKT7-CqWRKY31-2 载体自激活和毒性验证

2.2 CqWRKY31 互作蛋白的筛选

以pGBKT7-CqWRKY31-1为诱饵蛋白与冬瓜均一化cDNA 酵母文库进行杂交，将可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上生长的菌落挑出做插入片段PCR 扩增，并对PCR 产物进行测序，得到45个与节瓜CqWRKY31 有潜在互作关系的蛋白。

2.3 CqWRKY31 酵母双杂交回转验证

阳性克隆质粒与pGBKT7-CqWRKY31-1 共转化Y2H gold 酵母感受态细胞，涂布SD/-Leu/-Trp二缺平板，培养3～5 d，拍照。二缺平板长出的单克隆，涂布SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（x-α-gal）四缺平板，5～14 d 后拍照。除阴性对照外，所有45 个共转化的菌株和阳性对照均可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 四缺平板上正常生长。除阴性对照和3 个共转化菌株（编号22、23 和28）外，其余42 个共转化菌株均可在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（x-α-gal）平板上生长（图3），表明这42 个蛋白与CqWRKY31 在酵母中存在相互作用关系（表2）。在这42 个互作蛋白中，包括10 个SRC2 或SRC2 同源蛋白、3 个E3 泛素蛋白连接酶、6 个DNA 损伤诱导蛋白、3 个AT-hook核定位蛋白等。

图3 45 种蛋白与CqWRKY31 互作的回转验证

表2 CqWRKY31 的42 种潜在互作蛋白Blast 比对结果

3 讨论与结论

WRKY 类转录因子广泛参与植物生物和非生物胁迫响应进程。Mao 等（2017）前期报道，CqWRKY31 可能为节瓜响应镰刀菌酸胁迫的正调控因子。经Blast 比对分析，节瓜CqWRKY31 与冬瓜基因组中BhWRKY41为同一基因，与甜瓜、南瓜和拟南芥WRKY41 同源。拟南芥WRKY41 过表达影响植株对不同病原菌的抗性水平（Higashi et al.，2008）。棉花WRKY41 与拟南芥WRKY41同源，可能通过调节气孔关闭、活性氧（ROS）清除和抗氧化基因的表达来增强植物对逆境的耐受性（Chu et al.，2015）。

鉴于CqWRKY31 的基因功能尚不清楚，本试验通过构建诱饵载体进行酵母双杂交筛选CqWRKY31 的潜在互作蛋白并进行回复验证试验。CqWRKY31 蛋白全长为361 aa，由于整个WRKY31 蛋白有毒性，无法用来后续筛库，因此选择CqWRKY31 的2 个部分序列CqWRKY31-1 和CqWRKY31-2 进行后续分析。CqWRKY31-1 片段对应CqWRKY31 蛋白129～191 aa，CqWRKY31-2片段对应CqWRKY31蛋白192～361aa。CqWRKY31-1包含完整的CqWRKY31蛋白的WRKY保守结构域（130～190aa），因此，CqWRKY31-1 可以代表CqWRKY31 基因的主要蛋白功能。经过酵母文库筛选和回复验证，共筛选到42 个与CqWRKY31 在酵母中有互作关系的蛋白。在这42 个互作蛋白中，包括10 个SRC2 或SRC2同源蛋白、3 个E3 泛素蛋白连接酶、6 个DNA 损伤诱导蛋白、3 个AT-hook 核定位蛋白等。SRC2和SRC2 同源基因在植物应对非生物胁迫和宿主、非宿主病原菌侵染过程中起着重要的作用。拟南芥冷诱导蛋白SRC2 在低温胁迫下诱导表达，该基因通过增强ROS 的产生，提升植物应对低温胁迫的能力（Kawarazaki et al.，2013）。辣椒-在细菌、病毒侵染，CaCl、低温处理后表达水平显著提高，表明-在植物应对非生物、生物胁迫过程发挥了重要作用（Kimet al.，2008）。辣椒疫霉属于elicitin 基因家族，可以诱导植物超敏性程序性细胞死亡。酵母双杂交发现辣椒SRC2-1 与互作，基因沉默SRC2-1可以提升辣椒对辣椒疫霉的抗性水平（Liuet al.，2015）。在大豆中，克罗莫结构域蛋白LHP1 通过与WRKY40 启动子结合和降低大豆内源水杨酸含量两种方式抑制WRKY40 的表达水平，进而负调控大豆对大豆疫霉的抗性（Zhang et al.，2021）。此外，张慧媛等（2018）发现小麦耐盐相关转录因子WRKY33 与叶绿素a-b 结合蛋白及泛素结合酶等有互作关系，表明WRKY33 可能通过与这些蛋白互作调控小麦的耐盐性。本试验发现，克罗莫结构域蛋白LHP1、叶绿素a-b 结合蛋白和E3 泛素蛋白连接酶同样与CqWRKY31在酵母中存在互作关系。

综上所述，本试验筛选到与CqWRKY31 存在互作关系的蛋白，进一步结合互作蛋白的功能注释和前人研究结果，发现CqWRKY31 可能与SRC2、LHP1、叶绿素a-b 结合蛋白和E3 泛素蛋白连接酶通过蛋白互作调控节瓜的FA 抗性，为揭示CqWRKY31 介导的节瓜响应FA 胁迫机制提供了新的线索。