HPLC法测定三香跌打损伤酒中马钱子碱和士的宁含量

孙建彬，越 亮，王 欣，胡 彬，彭 爽，罗维早*

(1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.太极集团重庆桐君阁制药厂有限公司，重庆 401336)

三香跌打损伤酒由柴胡、当归、川芎、赤芍、黄岑、桃仁、五灵脂、骨碎补(烫)、续断、马钱子(沙烫)、苏木、红花、三棱、莪术、乳香(醋炙)组成，具有舒筋活血、散瘀止痛的功能，主要用于跌打埙伤、瘀血凝滞、红肿疼痛、筋络不舒等症。该药含有毒性中药马钱子，中药马钱子的生物碱成分马钱子碱和士的宁有剧毒，士的宁和马钱子碱对小鼠灌胃给药的半致死量LD50分别为 3.27和233 mg/kg。士的宁成人一次服用5～10 mg 可致中毒，30～100 mg 可致死亡，儿童的致死量仅为15～30 mg[1-2]。2020版《中国药典》一部规定马钱子中士的宁的含量应为1.20%～2.20%，马钱子碱不得低于0.80 %[3]。马钱子碱和士的宁作为该制剂中的有效成分和毒性成分，且士的宁治疗剂量与中毒剂量非常接近，必须对其严格控制。本研究通过建立三香跌打损伤酒中马钱子碱、士的宁的含量测定方法，为其制定合理的限度。

1 仪器与试药

岛津LC-20 A型高效液相色谱仪；CPA225D型电子天平：十万分之一，Sartorius；PB-10 pH计，Sartorius。马钱子碱对照品(批号：110706-200505，中国药品生物制品检定所)，士的宁对照品((批号：110705-200306，中国药品生物制品检定所)，三香跌打损伤酒(批号：2018070001、2018070002、2019 050001、2019050002、2019050003、2019050004、2019050005、2019050006、2019050007、2019050 008)及三香跌打损伤酒-马钱子阴性样品(批号：2019050009)由太极集团重庆桐君阁药厂有限公司提供，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Gemini-NX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-50 mmol/L碳酸氢氨(氨水调节pH=9.5，B)，按表1要求进行梯度洗脱，柱温：30 ℃，流速：1 mL/min，检测波长：260 nm。在上述色谱条件下，马钱子碱、士的宁之间以及与其他组分之间分离度良好，马钱子碱、士的宁的理论塔板数均>5 000，见图1、图2。

表1 梯度洗脱

注：A 混合对照品；B 三香跌打损伤酒；C 三香跌打损伤酒-马钱子阴性。

注：A混合对照品；B三香跌打损伤酒。

2.2 混合对照品溶液的配制

分别取马钱子碱约10 mg、士的宁约12 mg，精密称量，置50 mL容量瓶中，用60%乙醇制成每1 mL含有212.2 μg马钱子碱、252.6 μg士的宁的混合对照品储备液，于4 ℃冰箱中保存，备用。取混合对照品储备液，用60%乙醇稀释20倍，制成含马钱子碱10.61 μg、士的宁12.63 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品2 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.4 线性范围

将混合对照品储备液依次稀释2倍，取混合对照品储备液及其各稀释液进样。以样品浓度对峰面积的积分值进行线性回归处理，得马钱子碱、士的宁回归方程，结果表明马钱子碱、士的宁在该条件下线性良好，结果见表2。

表2 马钱子碱、士的宁回归方程及线性范围

2.5 检测限和定量限的测定

将马钱子碱和士的宁最低浓度对照品溶液逐级稀释，注入液相色谱仪，观察其信噪比(即S/N)，当S/N≈3时，此时的浓度为检测限，当S/N≈10时，此时的浓度为定量限，结果见表3。

表3 马钱子碱、士的宁的检测限和定量限

2.6 精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，记录马钱子碱、士的宁的峰面积，结果表明精密度良好，结果见表4。

表4 精密度测定结果(按峰面积积分值计)

2.7 重复性试验

取三香跌打损伤酒(批号：2019050004)，按“2.3”项下要求制备样品6份，10 μL，测定马钱子碱、士的宁的含量，结果表明三香跌损伤酒在该条件下重复性良好，结果见表5。

表5 重复性试验测定结果

2.8 稳定性试验

取三香跌打损伤酒(批号：2019050004)，按“2.3”项下要求配制后分别于0、4、8、12、24 h进样，记录马钱子碱、士的宁的峰面积，结果见表6。结果表明处理后的样品在1 d内稳定。

表6 稳定性试验测定结果(按峰面积积分值计)

2.9 加样回收率

精密量取三香跌打损伤酒(批号：2019050004)1 mL至10 mL容量瓶，加入马钱子碱和士的宁浓度分别为53.05 μg/mL、63.15 μg/mL的混合对照品溶液1 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，过滤。测定马钱子碱、士的宁含量，计算加样回收率。马钱子碱、士的宁的平均回收率及RSD%见表7。各组分的RSD%≤2.0%，表示测定结果准确。

表7 三香跌打损伤酒的加样回收率测定结果 (n=6)

2.10 三香跌打损伤酒含量测定

取10批次三香跌打损伤酒，按“2.3”项下要求制备样品，按“2.1”项下色谱条件测马钱子碱、士的宁含量，结果见表8。

表8 三香跌打损伤酒的含量测定结果 (n=3)

3 结论

2020版《中国药典》马钱子含量测定项下流动相为乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值至2.8)(21∶79)，含马钱子的成方制剂中也大多使用此流动相，文献中关于马钱子的中药品种大多采用此含量测定方法[4-7]。但此流动相含有离子对试剂，配制较为复杂，使用不当易造成基线不稳、峰分叉等问题。文献中有关马钱子碱、士的宁含量测定方法，流动相大多为酸性条件(磷酸或醋酸调节pH为2～3)[8-9]。在研究中发现，使用酸性条件的流动相，马钱子阴性有干扰，且会有峰形拖尾，甚至分叉的现象发生。考察了碱性环境流动相(氨水调节pH至9.5)，发现峰形对称性好；通过比较乙酸铵溶液、碳酸氢氨溶液作为流动相对分离度的影响，发现碳酸氢氨分离度能够达到要求，且阴性无干扰。

使用PDA检测器，士的宁光谱图显示其最大吸收波长为255 nm，而马钱子碱最大吸收波长为265 nm，选定检测波长为260时，士的宁峰面积变化不大，而马钱子碱峰面积变大较多，故选定检测波长为260 nm，可兼顾士的宁、马钱子碱检测，与2020版《中国药典》马钱子含量测定项下检测波长一致。

三香跌打损伤酒中使用的是马钱子炮制品，考虑到士的宁的治疗窗较窄，应严格限定其含量。结合本品制备特点及10批次样品含量测定结果，规定本品每 1 mL含士的宁应为50～75 μg，马钱子碱应不少于40 μg，其中士的宁的成人每日最大使用剂量少于中毒剂量5 mg。

本研究建立了三香跌打损伤酒中马钱子碱、士的宁的含量测定方法，该方法分离度达到含量测定要求，经方法学验证，各项指标相对标准偏差均在2%以内，且符合药品质量标准分析方法验证指导原则的要求，证实该方法准确可靠。