人参皂苷Rb1对斑蝥素致SD大鼠肝毒性保护作用

胡 超，刘艳丽，许琼明，李笑然，杨世林

(1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2.苏州大学，江苏 苏州 215123)

斑蝥作为传统的中药，其单萜化合物斑蝥素是其主要的活性成分，在临床上对于多种恶性肿瘤有一定的治疗作用，尤其对肝癌疗效显著[1-2]。斑蝥素虽疗效较好但也有一定的毒副作用，且治疗剂量与中毒剂量非常相近，因服用斑蝥素导致中毒或死亡的病例时有报道[3]。研究报道[4]，斑蝥素通过干扰大鼠肝脏甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和类固醇激素生物合成诱导肝细胞及其细胞器受损，上调大鼠肝脏中TNF-α、IKK-α、caspase3蛋白表达引起肝脏炎性浸润、坏死和出血[5]，抑制小鼠肝脏P450酶家族中的CYP2D6和CYP3A4表达，通过TLR4、NF-κB介导的炎症反应[6]，通过内质网应激诱导肝细胞坏死和凋亡引起肝脏的损害[7]，人参皂苷Rb1可下调高脂血症SD大鼠肝细胞焦亡相关因子NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18及mRNA表达的减轻肝脏损伤和脂质沉积[8]。张苗苗[9]对艾迪注射液(斑蝥、人参、黄芪、刺五加)的“拆-分”方研究发现，人参皂苷Rb1可减轻斑蝥对QSG-7701(人肝细胞)细胞毒作用，但其减毒机制目前还不清楚。本研究以斑蝥素诱导SD大鼠肝损伤为模型，观察人参皂苷Rb1对斑蝥素介导肝损伤的影响，并探讨其可能的机制，为斑蝥素肝脏损伤的干预及艾迪注射液配伍规律提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级成年雄性SD大鼠40只，体质量为180～220 g，由上海斯莱克生物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)NO.2013-0003。大鼠饲养在(21±2)℃的动物房中，环境安静，通风良好，光照12 h明暗交替。实验经苏州大学实验动物伦理委员会批准，严格按照实验室动物相关规范进行操作。

1.1.2 药物与试剂 斑蝥素，纯度>98.8%，由苏州大学天然药物教研室提供；人参皂苷Rb1，纯度>95.0%，购于江西本草天宫科技有限责任公司。

1.1.3 试剂与仪器 一抗：p-MAPK Family Kit(批号：9910)，MAPK Family Kit(批号：9926)均购于美国CST公司；二抗：羊抗兔多克隆抗体(批号：111066)和羊抗鼠多克隆抗体(批号：110692)购自美国KPL公司。BIO-RAD电泳仪，Bio-Rad公司；VCX130型细胞超声破碎仪，美国SONICS公司；LI-COR型红外激光成像系统，美国Odssey公司；C8000全自动血生化分析仪，美国雅培公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与模型制备 取雄性SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只，分为正常组，斑蝥素组(0.56 mg/kg)，斑蝥素(0.56 mg/kg)+人参皂苷Rb1低、高(5、10 mg/kg)剂量组。正常组给予等量的生理盐水，人参皂苷Rb1提前4天给药，在第5天至19天，提前1 h给人参皂苷Rb1再给斑蝥素，各组均腹腔注射给药(0.01 mL/g 体质量)，每天记录动物体质量，并按照体质量调整给药量，同时记录动物死亡情况。实验结束后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血5 mL于EP管内，4 ℃条件下3 500 r/min 离心15 min，取上清液，用于血生化检测。随机取3只大鼠的肝脏组织于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中(pH=7.4)固定，再取部分肝脏组织用生理盐水轻微浸泡洗涤后保存于液氮罐。

1.2.2 血液生化检测 取离心后的上清液，用全自动血生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平。

1.2.3 组织病理学检测 取用4%多聚甲醛固定后的肝脏组织，经乙醇脱水、石蜡包埋后，切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察组织病理学改变。

1.2.4 Western blot分析检测ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK蛋白表达 取液氮罐中肝组织称质量后置于冰上的碾钵中研细，加入含1% PMSF的RIPA细胞裂解液匀浆后，4 ℃高速(12 000 r/min)离心10 min，吸取上清液测蛋白含量，按比例加入5×SDS loading buffer后95 ℃变性8 min，经电泳、转膜、封闭，TBST漂洗后加一抗，4 ℃孵育过夜。12 h后TBST漂洗后加入二抗孵育1.5 h，TBST液避光漂洗后在红外激光成像系统扫描，用SigmaScanPro 5软件分析条带灰度值。实验重复3次。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 对血清中ALT、AST水平的影响

与正常组比较，斑蝥素组ALT和AST水平均显著升高(P<0.05)；给予人参皂苷Rb1提前干预过后，与斑蝥素组比较，ALT和AST水平均显著降低(P<0.05，P<0.01)，人参皂苷Rb1低剂量组比高剂量组干预效果更好，见图1。

注：与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与斑蝥素组比较*P<0.05，**P<0.01。

2.2 对肝脏病理变化的影响

HE结果显示，与正常组比较，斑蝥素组肝小叶结构模糊，肝索絮乱，肝细胞轮廓模糊，呈轻微空泡样变化；给予人参皂苷Rb1提前干预过后，其低剂量组能明显改善肝组织受损情况，高剂量组肝索结构有所改善，但伴有水肿现象。见图2。

注：A.正常组；B.斑蝥素(0.56 mg/kg)组；C.人参皂苷Rb1 5 mg/kg组；D.人参皂苷Rb1 10 mg/kg组。

2.3 对MAPK信号转导通路相关蛋白的影响

Western blot显示，与正常对照组比较，给予斑蝥素组大鼠肝脏中蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK显著上调(P<0.01)；给予人参皂苷Rb1提前干预过后，低剂量组均可显著下调p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK的表达(P<0.05，P<0.01)，高剂量组显著下调p-ERK、p-JNK蛋白的表达(P<0.01)，对p-p38 MAPK的表达无显著差异(P>0.05)。见图3、表1。

图3 人参皂苷Rb1对肝脏MAPK信号通路相关蛋白变化的影响

表1 人参皂苷Rb1对肝脏p-ERK，p- JNK，p-p38 MAPK相对表达的影响

3 讨论

临床研究表明斑蝥素是抗肝癌的有效成分，其治疗量对肝脏有一定毒副作用[10-11]。本实验结果显示，给予斑蝥素后，SD大鼠血清血AST及ALT水平均显著升高；病理观察见肝脏部分细胞核分裂、溶解、坏死，与已有研究一致[7，12-14]，确保了肝毒性建模成功。人参皂苷Rb1是人参的主要活性成分之一，近年来研究发现，其可预防肝脏的缺血再灌注损伤，改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝毒性，抑制四氯化碳诱导的肝纤维化及肝脏脂肪沉淀[15]，降低血清ALT和AST水平，进而减轻小鼠肝脏的功能和形态学损伤[16]，本次实验结果显示，人参皂苷Rb1提前干预过后，可显著改善斑蝥素AST及ALT水平及肝脏的病理变化，且人参皂苷Rb1低剂量组接近正常组水平，并改善动物的生活质量和提高动物的存活率。人参皂苷Rb1低剂量组较高剂量组显示更好的干预效果，是否高剂量的人参皂苷Rb1对肝脏有一定的影响，或在较高的剂量药物之间也存在相互影响仍有待进一步研究。

细胞生存依赖细胞能接受一定的胞外信号，通过细胞膜受体传导入胞质或经一系列传导系统入核调控细胞增殖、分化和生长[17]。真核细胞对外界条件的刺激反应活性调节主要包括细胞外信号调节激酶ERK，cJun-N氨基末端激酶JNK和丝裂原活化蛋白p38 MAPK三条并行的MAPKs信号转导通路，主要与细胞的增殖、分化、存活和死亡密切相关[18]，在NCI-H46细胞中，斑蝥素抑制P-ERK、p-JNK、p-P38表达来阻碍细胞转移和增殖[19]。有研究报道[20]人参皂苷Rb1可通过激活p-ERK、p-p38MAPK表达发挥抗炎、抗凋亡，进而对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用，通过调控MAPK信号通路下游炎症因子NF-κB的磷酸化变化减轻对乙酰氨基酚对小鼠肝脏的毒性[16]，通过JNK信号通路下调IL-6、IL-1β和TNF-α的表达改善糖尿病大鼠肝损[21]。本研究也显示，人参皂苷Rb1可通过上调斑蝥素对p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白的抑制作用，调节细胞外信号移位到核内，进而调节一系列转录因子促进肝脏细胞的存活和增殖以及发挥抗凋亡作用保护肝脏。

综上，适量的人参皂苷Rb1对斑蝥素介导的肝损伤有很好的保护作用，主要和上调MAPK相关蛋白ERK、JNK、P38MAPK有关，由于没有用MAPK信号通路的抑制剂及探索和上下游的关系，其具体的机制有待研究。