肠愈灌肠方对湿热型溃疡性结肠炎大鼠P38MAPK及相关炎性因子影响研究

张欣雨，李 明，纪 翔

(1.安徽中医药大学 研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院 肛肠科，安徽 合肥 230038)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)患者症状痛苦，严重影响生活质量，且具有癌变倾向，因此及时控制病情并缓解症状为临床治疗目标，但该病反复发作，迁延难愈，且发病机制尚未十分明确，临床治疗存在长期用药副作用多，停药后复发率高，患者依从性差等问题。中医药治疗UC各阶段均有其治疗原则及方法，具有症状缓解持久，复发率相对较低及副作用小等优势。肠愈灌肠方在临床上多用于治疗证属大肠湿热型UC，但却鲜有对其作用机制和路径的研究。研究表明，P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase，P38MAPK)参与并诱导免疫应答，在UC的发生发展中具有重要影响[1]。本研究采取现代实验技术观察肠愈灌肠方对UC大鼠P38MAPK及相关细胞因子的调控，从免疫炎症反应角度探析其治疗UC的作用机理，丰富该经验方治疗UC的理论基础。

1 实验材料

1.1 SPF实验大鼠

本实验选用 62 只健康 Wistar 大鼠(2月龄)，来源于安徽省实验动物中心(动物生产许可证：SCXK(皖)2011-002)，雌雄各半，体质量(160±20)g。实验室为SPF级，空调恒温23 ℃，湿度50%±5%，明暗交替12 h/12 h，室内通风换气，食灭菌固体饲料和标准饮用水。

1.2 药材

柳氮磺吡啶肠溶片1 g，购于安徽省中医院药房，产自上海福达制药有限公司(批号：国药准字H31020840)；肠愈灌肠方：黄柏6 g(浓缩颗粒剂0.5 g)、白及10 g(浓缩颗粒剂1.3 g)、苦参6 g(浓缩颗粒剂0.5 g)、仙鹤草15 g(浓缩颗粒剂0.9 g)。浓缩颗粒剂供自四川新绿色药业科技发展有限公司。加锡类散1 g(购自杭州胡庆余堂药业有限公司)。

1.3 实验试剂及器材

2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)、50% 乙醇、生理盐水、水合氯醛；TNF-α ELISA 试剂盒(批号：93556038)、IL-4 ELISA 试剂盒(批号：230441235)及IL-10 ELISA 试剂盒(批号：10369R)；BCA 蛋白定量试剂盒购自上海 BestBio 公司。一抗：兔抗鼠P38MAPK一抗；二抗：IgG-HRP羊抗兔二抗(上海生工生物工程股份有限公司)。VELOCI-TY 高速低温离心机(美国伯乐公司)；组织匀浆机(上海净信Tissuelyser-192)；Western-blot所用电泳槽及转运槽(Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 造模方法[2]

环境与饮食干预，联合TNBS/乙醇混合试剂灌肠法，空白组12只大鼠予常规饲养，余50只大鼠给予肥甘饮食(普通饲料掺入12%动物脂肪、10%糖浆融合加工)，隔日交替灌喂56度白酒20 mL/kg，后将大鼠放入人工气候箱(参数：高温35 ℃、高湿95%)中，共21 d，以建立内因湿热型模型。造模前一天，大鼠仅饮水，并用棉签擦净肛周秽物，促进排空大便，之后用水合氯醛麻醉，固定大鼠背部于解剖台上，取直径约2 mm灌肠管用石蜡油润滑后，经肛缘缓慢插至结肠约8 cm处，再把TNBS和乙醇混合物注入肛门上段，将大鼠头低脚高位倾斜倒置45°，时间持续2 min，使得溶液能充分进入肠腔内，清醒后自由饮食，观察并记录大鼠情况。3周后评估被抽取大鼠造模水平。造模成功标准：大鼠结肠黏膜充血水肿明显，纹理模糊，部分节段见散在溃疡、糜烂及出血点，甚者附着白色伪膜，与周围脏器有不同程度黏连，肠腔梗阻或狭窄，结肠长度缩短明显。

2.2 分组与药物干预

采用随机数字表法，对62只SPF 级健康大鼠进行分组，分别为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组，肠愈灌肠方低、中、高剂量组，空白组12只，其余各组均为10只。空白组(12只大鼠)不作任何干预措施，每日按时给予喂养。模型组每日予3 mL生理盐水灌肠。按照人与实验大鼠体型换算系数法[3]，计算有效给药剂量，肠愈灌肠方组每日按低剂量(浓度为0.09 g/mL，相当于成人临床日需量的2.5倍)，中剂量(浓度为0.18 g/mL，相当于成人临床日需量的5倍)，高剂量(浓度为0.36 g/mL，相当于成人临床日需量的10倍)，各3 mL灌肠。柳氮磺吡啶组予柳氮磺吡啶，研磨成粉后用蒸馏水稀释成均匀混悬液，浓度0.02 g/mL(相当于成人临床日需量的5倍)，取3 mL灌肠。每日固定时间给药1次，持续14 d为1治疗周期。

2.3 标本采集

各组动物经相关灌肠给药治疗14 d后，禁食过夜24 h，期间饮水不限，用异氟烷吸入麻醉，低温无菌分离腹主动脉，取血5 mL，离心后取上清-80 ℃保存，用于ELISA检测。将大鼠断颈处死，沿纵轴自肛门上端约8 cm处剖开肠腔，取病变最明显处结肠组织约6 cm，用4 ℃生理盐水清洗肠腔并用锡纸包裹，置于液氮冷冻，随后用无酶冻存管-80 ℃保存，备Western-blot法检测。

2.4 一般情况观察

自实验开始每日逐只称量大鼠体质量，观察大鼠精神反应状态，进食量，泄泻程度，毛发密度及光泽度等，采用邻甲苯胺法检测粪便隐血。根据计算公式：DAI=(体质量下降分数+粪便黏稠度+便潜血)/3，评估UC疾病活动指数[4]。见表1。

表1 大鼠DAI评分

2.5 Western-blot检测肠黏膜P38MAPK蛋白水平

截取约50 mg解冻后的肠标本研磨破碎并加入200 μL RIPA试剂(含PMSF)，冰浴30 min后低温离心10 min(4 ℃，12 000 rpm)。取上清，用BAC法进行蛋白定量。将总蛋白提取液与1/5的loading buffer均匀稀释，沸水浴使蛋白变性。每孔上样20 μL，根据蛋白分子量大小制备凝胶，随后开始电泳分析蛋白。湿法电转至0.45 μm的PVDF膜，用5%脱脂奶粉+3% BSA将PVDF膜37 ℃温育1～2 h。把PVDF膜放于稀释至1∶2 000的兔抗鼠P38MAPK一抗培育液中，4 ℃静止过夜，洗膜5次。取出PVDF膜，浸于稀释至1∶3 000的HRP羊抗兔二抗培育液中，37 ℃结合反应1～2 h，TBST快摇洗膜5次。用化学发光(ECL)胶片显影。实验均重复3次。

2.6 大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α含量比较

实验结束后，将从腹主动脉取得的血液置于离心机离心10 min(4 ℃，3 000 r/min)，收集上清液于-80 ℃ 保存备测。按照 ELISA试剂盒操作规程测定血清IL-4、IL-10以及TNF-α的水平。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况

空白组大鼠反应快，饮水进食排便均正常，皮毛厚而光滑，粪便为深褐色，呈颗粒状；模型组第2天出现精神不振、嗜睡、毛干枯稀疏，食物摄入量降低，第3天时有血便，第5天出现脓血便；1星期后大鼠体质量明显降低，出现少食懒动、皮毛松散枯槁、嗜睡、黏液脓血便、反应迟钝等症状，生存能力明显下降；药物干预2周后，相较于模型组，各治疗组症状明显减轻，动作敏捷，毛发有光泽、饮食、粪便、体质量接近正常，身体发育良好。实验期间由于灌肠操作不当，模型组大鼠死亡3只，肠愈灌肠方低、中剂量组及柳氮磺吡啶组各死亡2只，空白组及肠愈灌肠方高剂量组未见死亡。肠愈灌肠方中、高剂量组一般情况较好，体质量恢复正常，大便性质明显改善，皮毛有光泽，活动增多，DAI评分比模型组显著降低(P<0.05)；肠愈灌肠方和柳氮磺吡啶组组间差异无统计学意义(P>0.05)，但肠愈灌肠方高剂量组DAI评分明显低于柳氮磺吡啶组。见表2。

表2 肠愈灌肠方对各组大鼠 DAI 评分影响

3.2 各组大鼠P38MAPK表达水平比较

相较于空白组，模型组大鼠肠黏膜P38MAPK含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，肠愈灌肠方(0.36 g/mL、0.18 g/mL)组和柳氮磺吡啶(0.02 g/mL)组均可明显降低结肠组织P38MAPK蛋白表达量，组间有统计学差异(P<0.05)；各治疗组间比较，肠愈灌肠方(0.18 g/mL、0.36 g/mL)组及柳氮磺吡啶组(0.02 g/mL)组均优于肠愈灌肠方(0.09 g/mL)组，组间比较有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠之间P38MAPK蛋白表达比较

3.3 大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α含量比较

相较于空白组，模型组大鼠的IL-4、IL-10含量较低，TNF-α的含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，柳氮磺吡啶组和肠愈灌肠方组大鼠血清TNF-α显著降低，IL-4、IL-10 的含量上升，其中以肠愈灌肠方高剂量组最为显著，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清中细胞因子含量比较

4 讨论

近年来，由分子机制角度切入，探索炎症介质及其通路在UC肠道病变中的作用成为研究热门。有关实验研究表明[5-6]，UC 的发生与机体组织内抑炎因子和促炎因子(或基因和蛋白)的紊乱状态有密切关系，这一观点得到了多数学者的认同[7]。

诸多研究表明，UC活动期人群的血清TNF-α含量较正常人群该项指标升高显著，病情程度越重，血清TNF-α升高越明显，经治疗，血清TNF-α水平会逐渐下降。可见，TNF-α是UC疾病发展过程中的关键细胞因子。IL-4、IL-10与TNF-α不同，这两种刺激分子在UC的发病过程中展现降低趋势，对肠黏膜具有保护作用。IL-4主要由活化的T细胞分泌而来，具有抑制炎症与免疫抑制等多种生物学效力，在肠道黏膜微环境稳定中发挥着重要作用[8]。IL-10可抑制部分炎性细胞因子合成，Th2细胞是其主要来源。研究表明，将小鼠IL-10基因剔除，可使小鼠诱发结肠炎，之后予以IL-10可防治其发生。本实验亦表明，IL-10在保持肠道黏膜免疫调节方面，作用极其重要[9]。此外，对于直肠炎，IL-4、IL-10 具有逆转 Th1/Th2 细胞活化作用，加强 Th2型反应，使得黏膜修复得以改善。

P38MAPK主要位于细胞浆内，其活性在正常情况下很低，可被特定细胞因子刺激而活化，而后通过调控多种蛋白激酶与转录因子，介导细胞应激免疫炎症反应，与炎症的发生发展过程息息相关[10-11]。研究发现，P38MAPK 在 UC 肠黏膜中的蛋白水平显著提高，可能是通过调节下游细胞因子(如 IL-1β、IL-10、TNF-α)的表达，从而参与了 UC 的发生[12]。Li等[13]研究表明，姜黄素可阻断P38MAPK蛋白产生，下调下游炎症因子(IL-6、TNF-α)等的表达，从而改善结肠黏膜对促炎症因子的免疫防御机能。

本实验结果表明，肠愈灌肠方中、高剂量组和柳氮磺吡啶组对UC大鼠的生存状况改善明显，结肠P38MAPK蛋白和血清中TNF-α的表达下调明显(P<0.05)，提示肠愈灌肠方治疗大肠湿热型UC具有明显效果，可能与其降低结肠组织P38MAPK的蛋白表达，从而调控血清各细胞因子的水平如TNF-α、IL-4、IL-10，以达到抑制炎症性反应，调节免疫平衡，修复黏膜屏障的效果有关，今后应深入研究该方，为UC治疗提供新的思路与方向。