三种不同试验方法在牛结核检测应用中的比较

郑汝芸，罗鹏飞，王金泉，舒 展，李爱巧，赵玉康，王海燕，张 芳

(1.新疆阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心，新疆 阿勒泰 836500；2.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；3.新疆乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，乌鲁木齐 830063)

牛结核病主要由牛分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病[1]，该病在全球范围内广泛流行[2]，牛结核病可以通过病畜传染给其他动物或人[3]，世界动物卫生组织(OIE)将其列为B 类动物疾病[4]。 目前，牛结核病的发病率在我国一些省份呈上升趋势，有的已达到6%甚至更高的阳性检出率[5]，该病在新疆各地州的发病率一直都比较高，严重威胁公共卫生安全,尤其是在农牧区[6]。 因此，建立可靠的诊断检测技术对防控该病至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物：按照牛存栏密度、养殖方式和养殖场(户)、散养户的数量及农牧民配合程度，在阿勒泰地区对A-H 共8 个区域内的8580 头牛进行牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验， 排除满3 月龄以内犊牛、刚配种或临产母牛、瘦弱病牛一律不检测。

受试血清： 随机选取牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应结果为阴性的100 头牛进行肝素抗凝血采集， 且对牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应初筛结果为阳性的6 头牛采集全血， 以上合计共106份，分离血清待检。

试验材料：牛结核分枝杆菌标准病原由新疆农业大学提供；提纯牛型结核菌素由阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心提供(哈药集团有限公司生产)；牛结核γ-干扰素ELSIA 检测试剂盒(青岛瑞尔生物技术有限公司生产)；DNA 提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司生产)。

试验器材：20 μL 加样枪、24 孔培养板、塑料吸头、酒精棉、连续注射器、生物安全柜、电子天平、超纯化水机、恒温培养箱、移液器、微量振荡器、电子游标卡尺、注射器、个人防护用品等。

1.2 方法

1.2.1 牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验

检测所用方法参照国标《动物结核病诊断技术》(GB/T 18645-2002)[7]操作。

将待检牛只全部编号后，在颈侧中部上1/3 处剪毛，直径约10 cm。 用游标卡尺测量注射部位中央皮皱厚度，做好记录。用75%的酒精棉消毒注射部位，然后皮内注射0.1 mL 的结核菌素原液，注射后局部应出现小泡。

皮内注射后经过72 h 判定结果，观察注射部位局部有无红肿热痛的炎性反应，并以游标卡尺测量术部肿胀区域(或部位)的大小和皮皱的厚度,做好记录。 在72 h 观察后呈阴性和可疑反应的牛须在第1 次注射的部位，以同样的剂量进行第二次注射，再经过48 h 观察结果。 对于阴性牛和疑似反应牛，在注射96 h 和120 h 再观察一次，以防止个别牛出现较晚的迟发性变态反应，所有结果全部进行记录。

判定标准:(1)阴性反应：注射部位无炎性反应，皮厚差(指注射PPD 前后皮皱测量厚度的差值)在2 mm 以下。(2)疑似阳性反应：局部炎性反应不明显，皮厚差≥2.0 mm，＜4 mm。(3)阳性反应：局部出现明显的炎性反应，皮厚差≥4.0 mm。 凡判定为疑似阳性反应的牛，于第一次检疫后60 d 进行复检，其结果仍为可疑，经60 d 再复检，如仍为疑似反应，则直接判定为阳性。

1.2.2 体外检测γ-干扰素法

检测所用方法参照国标《牛结核病诊断体外检测γ-IFN》(GB/T 32945-2016)[8]操作。

1.2.3 PCR 检测方法

将抗凝血按照DNA 提取试剂盒提取DNA。(1)吸取200 μL 血样于1.5 mL EP 管中，200 μL GA 缓冲液，震荡；(2)200 μL GB，颠倒混匀，70 ℃、10 min；(3)200 μL 无水乙醇，混匀，全部加入到吸附柱CB 3，10000 rpm、1 min，弃滤液；(4)500 μL 的GD 缓冲液于CB 3，10000 rpm、1 min，弃滤液；(5)600 μL PW漂洗液于CB 3，10000 rpm、1 min，弃滤液，重复1 次，弃滤液；(6)将吸附柱放入全新高压EP 管中，静置10 min，吸附柱膜正中加入60 μL TE 洗脱液，放置4 min，13000 rpm、2 min，收集EP 管内的DNA，-20 ℃保存。

PCR 参照段旭基等[9]牛结核杆菌和结核分枝杆菌IS 1081 基因(IS-1：CGACGCTCTGACCGACAAACT；IS-2：TGCTTGGCGGGTTCTTCG；324 bp) 扩增目的片段；PCR 扩增体系为：95 ℃5 min；94 ℃2 min，58 ℃1.5 min，72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃10 min；PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测， 将阳性产物送至上海生工进行测序。

1.3 数据分析

文中Kappa 系数计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验结果

2020年，对阿勒泰地区A-H 共8 个不同区域内的8580 头牛应用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验进行普检。 由表1 可以看出，该地区8 个不同区域内共完成牛结核检测8580 头，结核阳性牛6头(含2 份可疑品)，阳性率为0.07%(6/8580)。 其中，C 区域、D 区域、G 区域和H 区域牛结核检测阳性检出率均为0.00%，达到国家农业部净化标准(0.05%)；其余区域牛结核检测阳性检出率分别为A(0.14%，2/1430)、B(0.15%，0.08/1200)、E(0.08%，1/1300)、F(0.14%，2/1450)，阳性率均高于农业农村部净化标准。 结果表明，阿勒泰地区不同区域内牛结核病防控效果存在明显差异。

表1 2020 年阿勒泰地区不同区域牛结核检测结果

2.2 三种不同方法检测比对结果

对106 头份牛血清样本应用体外检测γ-干扰素法、PCR 检测方法分别于牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验进行对比。 由表2 可以看出，使用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验检出结核阳性牛6 头，阳性率为5.66%(6/106)；体外检测γ-干扰素试验检与PCR 方法检出结核阳性均为5 头，阳性率为4.72%(5/106)，与牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验检测之间的Kappa 值为0.81。体外检测γ-干扰素法、PCR 检测方法分别与牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验对比的阳性符合率均为83.33%(5/6)，阴性符合率为99.00%(99/100)，牛型结核菌素PPD 皮内变态反应试验敏感性高于体外检测γ-干扰素试验、PCR 检测方法。 从试验结果看,Kappa 值≥0.8，检验结果一致性很好。

表2 PCR 方法、体外检测γ-干扰素法与牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验比对结果

3 讨论

本试验共检测106 头份样品，牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试检测阳性率为5.66%(6/106)，体外检测γ-干扰素试验检与PCR 方法检测阳性率均为4.72%(5/106)，与牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应检测之间的Kappa 值为0.81。 Kappa 系数用于一致性检验，当Kappa 值≥0.80，说明检验结果一致性很好， 体外检测γ-干扰素法、PCR 检测方法分别与牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验对比的阳性符合率均为83.33%(5/6)，阴性符合率为99.00%(99/100)，而符合率为两种方法共同检测一致的结果，符合率高于85.00%，说明方法的检测结果较好。 牛型结核菌素PPD 皮内变态反应试验敏感性高于体外检测γ-干扰素试验、PCR 检测方法,以上方法的结果较为可靠，故这三种方法均可用于牛结核的检测。

在生产实际应用中，牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应是国家动物结核病检疫行业标准[10]，同时也是被国际贸易方指定的检测方法之一。但此种方法存在的误差较大，在大规模检测中，容易出现阳性漏检情况，如果检出的阳性牛一旦未进行处理，则会污染健康的牛群[11，12]。在实际检测工作中，牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验存在一定的非特异性。 测量注射部位的皮肤厚度时，游标卡尺等测量仪器需要经常核校，认为有必要时还应多次测量，不能仅凭检测人员的经验判定结果，认为接种部位没有明显的“凸起”就是正常，阴性结果，个别变态反应呈扩散状，表面虽不明显，但实际皮肤有增厚反应，必须借助游标卡尺测量后再判定。 还有很多天气因素、人为因素等，都会影响牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应结果。 综上所述，此方法受外界环境及人为因素的影响较为明显。

体外检测γ-干扰素法可以检测早期隐性或无症状感染牛只，敏感性及特异性较高，易于标准化，可以有效降低非特异性反应带来的假阳性问题[13]。对于牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验检测为疑似的牛可以直接应用体外检测γ-干扰素法进行复检，无需采用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验等待60 d 后进行复检。 但是体外检测γ-干扰素法需要在采血后8 h 内刺激抗原[14，15]，且试剂盒主要依靠进口，且价格昂贵，开展试验检测成本高。 除此之外，还需要生物安全柜、移液器、恒温箱等仪器设备来开展实验，对试验操作人员要求也比较高。

PCR 检测方法同样具有高敏感性和强特异性，特别是临床症状不明显或未出现临床症状的隐性感染等，且牛分枝杆菌IS 1081 具有高度的种属特异性，PCR 检测方法重复性较好，人为因素相对较小[16]，但试剂盒成本比体外检测γ-干扰素法试剂盒成本还要高。目前，牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验方法仍然是我国检疫标准， 体外检测γ-干扰素法、PCR 检测方法都可以作为牛结核病的辅助确诊方法，可以有效降低非特异性反应带来的假阳性问题。

4 结论

综合分析，牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应是我国动物结核病检疫的行业标准，操作简单、成本较低，被广泛应用于基层一线,但从试验结果的可靠性来讲还需要不断优化，体外检测γ-干扰素法和PCR 检测方法的敏感性及特异性均较高，都可以作为牛结核病的辅助确诊方法，可以有效降低非特异性反应带来的假阳性问题。但从成本上来讲，PCR 检测方法成本要高于体外检测γ-干扰素法。因此，对于牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验检测为疑似牛，可以直接应用体外检测γ-干扰素法或PCR 检测方法进行复检，无需采用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验等待60 d 后进行复检。