山羊痘病毒PC R 检测方法的建立

赵文年，刘 双，马兰英，徐全武，叶尔加那提，漆雯雯，齐姗姗，张启耀，韩佳佳，朱梦莹，马 莉，叶里哈孜，努尔孜哈

(乌鲁木齐县畜牧兽医站，乌鲁木齐 830036)

山羊痘(Goat pox)是一种急性、热性、高度接触性传染病，病原为山羊痘病毒(Goat pox virus，GTPV)，症状为发热、皮肤出现痘疹。 在世界较多国家和地区常有发生，造成巨大的畜牧经济损失[1，2]。 我国农业部将其确定为一类动物传染病，世界动物卫生组织(OIE)也确定为必须报告的动物传染病[3]。 新疆也有山羊痘疫情发生[4]。 近年来，随着乌鲁木齐县羊养殖数量增加，流通交易频繁，个别乡镇也有山羊痘发生。 山羊痘诊断主要依靠临床症状进行判断，采用疫苗免疫后，部分羊不出现明显痘疹，但仍然带毒排毒。 乌鲁木齐县兽医实验室无山羊痘病毒病原检测能力，出现临床诊断漏诊及病毒污染范围评估困难。因此，需要建立适合本实验室条件的检测方法。本文选取山羊痘病毒p32 基因序列保守区域作为检测目的片段，设计、合成一对扩增引物，成功扩增了该目的片段，建立了山羊痘病毒核酸的PCR 检测方法，为山羊痘病毒的临床诊断提供实验室诊断依据[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DNA 模板及检测样品

羊痘疫苗(批号：2012019)山东绿都生物科技有限公司产品；随机采集的羊口腔、鼻腔棉试子30 份。

1.1.2 仪器设备与试剂

A100 PCR 仪购自杭州朗基科学仪器有限公司；DYY-6C 型电泳仪购自北京六一仪器厂；GelSMART凝胶仪购自大龙兴创实验仪器有限公司；TIANGEN 2×Taq PCR MasterMix 购自TIANGEN；QIAamp MinElute Virus Spin kit 购自QIAGEN；DL 2000 DNA Marker 购自TaKaRa； 引物由上海生工生物科技有限公司合成；Gold View(1000x)购自浙江博而金科技公司；其余辅助试剂为国产。

1.2 方法

1.2.1 引物设计、合成

参考p32 基因序列及PCR 检测研究文献[6，7]以及GenBank 中公布的山羊痘病毒p32 基因序列(MG458381.1)，使用DNASTAR，比对保守序列，选取检测目的片段，用Primer 5.0，设计一对扩增引物，扩增片段预期218 bp。 上游引物：5’GTATTTCTACCAGTTTGAG3’；下游引物：5’CCAATGGATGGGATACAT AGTA 3’；用dd H2O 溶解至100 μmol，-20 ℃保存。

1.2.2 模板DNA 提取

山羊痘疫苗溶解液0.5 mL，按照QIAamp MinElute Virus Spin kit 试剂盒说明书操作，提取山羊痘疫苗DNA，作为模板DNA-20 ℃保存。

1.2.3 PCR 扩增

PCR 扩增反应体系为25 μL。2×Pfu PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，dd H2O补至25 μL。 PCR 扩增条件为：94 ℃5 min；94 ℃15 s，40 ℃～45 ℃20 s，72 ℃30 s，30 个循环；72 ℃5 min，4 ℃保存。 1%琼脂糖凝胶电泳PCR 产物，照胶查看扩增条带大小。

1.2.4 敏感性试验

模板DNA 用核酸测定仪测定浓度，然后进行10 倍倍比稀释，各取5 μL 进行PCR 扩增，对方法的最小灵敏浓度进行测试。

1.2.5 样品检测

随机采集的羊口鼻棉试子样品30 份，提取DNA 后，按照上述方法PCR 扩增，进行山羊痘的诊断，山羊痘疫苗提取DNA 作为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 PCR 方法的建立

最终反应条件为94 ℃5 min；94 ℃15 s，43 ℃20 s，72 ℃30 s， 扩增30 个循环；72 ℃5 min；4 ℃保存；检测结果见图1。

图1 GTPV 疫苗的PCR 扩增产物电泳图

2.2 PCR 的敏感性

核酸测定仪测定提取DNA 的浓度约为1.82×108拷贝/μL (30 ng/μL)。 结果稀释到105(1.82×105拷贝/μL)仍可检测出条带，说明该方法具有较高的敏感性，见图2。

图2 PCR 敏感性试验

2.3 样品检测

阳性对照扩增出明显条带，随机采集的羊口鼻棉试子样品30 份，均未扩增出218 bp 的特异性条带，见图3。

图3 羊口鼻棉试子PCR 检测试验

3 讨论

2019 年乌鲁木齐县出现山羊痘症状羊，经上级实验室检测为山羊痘病毒核酸阳性。 建立病原诊断的方法是开展病原流行病学调查和发病风险预警的重要手段。 因免疫抗体干扰，用血清学检测方法检测山羊痘效果也不理想[8,9]。同时血清学检测方法耗时、试剂盒价格昂贵等原因局限了其在实际当中的应用[8，9]。本方法的建立，为山羊痘的临床诊断提供实验室依据[10]。 但因为实验室无其它DNA 病毒及核酸，无法使用该方法检测其它(非羊痘)DNA 病毒，未验证本方法的实验特异性。引物的特异性只是通过BLAST 进行了检索，该方法的特异性为理论结论，存在一定缺陷[11]。

4 结论

本文建立了山羊痘病毒PCR 检测方法，该方法的敏感性浓度为1.82×105拷贝/μL，可储备为本实验羊痘病毒病原检测方法。