伏立诺他腹腔注射对严重烧伤早期大鼠心肌损伤和细胞凋亡的干预作用及其机制

孟祥熙，温海玲，郑金光，吴忠隐，胡森，孙奎

1 承德医学院附属医院烧伤整形科，河北承德067000；2 解放军总医院第四医学中心烧伤整形医学部；3 承德医学院附属医院血管外科；4 解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心

严重烧伤早期，心肌结构损伤，心肌细胞凋亡，心功能降低，诱发或加重休克，早期心肌损害和功能减退也是缺血缺氧的启动因素之一［1-2］。早期心肌细胞凋亡是心肌损伤及其并发症发生、发展的重要病理机制［3］。严重烧伤早期心功能受损，进一步加重休克，如果早期给予抗休克维持药物，保护心脏功能，能为后续治疗争取时间，提高救治成功率及生存率。伏立诺他（SAHA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。组蛋白3 第9 位乙酰化的赖氨酸（Ac-H3K9）是反映机体组蛋白乙酰化水平的一个可靠指标。以往研究证实，SAHA 能提高脓毒性休克小鼠的生存率，延长生存时间［4］，保护致死性烫伤大鼠心脏功能［5］，预防缺血—再灌注引起的心肌细胞内线粒体功能障碍［6］，但具体机制仍不明确。2018 年7 月—2020 年9 月，本研究观察了SAHA 对50% TBSA Ⅲ°烫伤大鼠心肌损伤和心肌细胞凋亡的干预作用，并探讨相应机制，为SAHA 在严重烧伤早期保护心脏功能、抑制心肌细胞凋亡的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 雄性SD 大鼠24 只，60～70日龄，体质量240～260 g，适应性饲养1 周以上，室温22 ～25 ℃，自由饮食。实验前12 h 禁食，自由饮水。SAHA、戊巴比妥钠购自Sigma 公司。Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb 购 自Cell Signaling 公司。TUNEL检测阳性对照制备试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。一氧化氮（NO）检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）抗体购自Abcam 公司。兔抗大鼠Ac-H3K9 抗体购自英国Abcam 公司。小鼠抗大鼠GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。肌酸激酶同工酶（CK-MB）测定试剂盒购自上海执诚生物科技有限公司。

1.2 动物分组及造模、给药方法 取24 只大鼠，随机分为假烫组、烫伤组和SAHA 组，每组8 只大鼠。戊巴比妥钠50 mg/kg 腹腔麻醉，剪除背部和腹部毛发，将大鼠放置在预制模板的矩形开口，露出裸露皮肤，同时保护剩余皮肤。烫伤组、SAHA 组建立烫伤大鼠模型：于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s造成50%TBSA Ⅲ°烫伤（烫伤深度经病理组织切片检查证实）。烫伤组和SAHA 组伤后分别于腹腔内注射0.25 mL 生理盐水和7.5 mg/kg 的SAHA（溶于0.25 mL 生理盐水）。假烫组采用37 ℃水浴，背部15 s，腹部8 s，处理后腹腔内注射0.25 mL 生理盐水。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.3 血浆CK-MB 检测 各组于伤后6 h 抽取腹主动脉血标本，离心后取血浆，全自动生化分析仪测定血浆CK-MB，评价心肌损伤程度。

1.4 心肌细胞凋亡率测算 各组于伤后6 h行腹主动脉穿刺，抽取血标本，然后处死动物，胸正中线剖开取心肌组织，TUNEL 法检测凋亡心肌细胞，荧光显微镜下观察，随机选取心肌组织区域中5 个非重叠高倍镜视野，计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，计算心肌细胞凋亡率。

1.5 心肌细胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO 检测 采用Western blotting 法检测心肌细胞中的Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9蛋白。取100 mg 大鼠心肌组织，加入1 mL 的RIPA 裂解液匀浆，于冰上静置20 min 后12 000 g 离心20 min，吸取上清并用BCA法进行蛋白浓度测定。行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭60 min 后分别加入相应一抗（GAPDH 抗体1∶5 000，iNOS 抗体1∶400，Caspase-3 抗体1∶1 000，Ac-H3K9 抗体1∶400），4 ℃孵育过夜。TBST 洗15 min、共3 次，分别加入相应二抗（1∶5 000），室温孵育30 min，TBST 洗15 min、共3次。用超敏ECL 发光液发光、曝光、显影、定影，用Image J 软件分析条带灰度，以目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。采用NO 检测试剂盒测定心肌细胞中的NO，按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆CK-MB 水平比较 假烫组、烫伤组、SAHA 组血浆CK-MB 水平分别为（585.6 ±46.1）、（5418.7 ± 292.9）、（3 475.3 ± 187.5）U/L。烫伤组血浆CK-MB 水平高于假烫组，SAHA 组血浆CK-MB水平低于烫伤组（P均＜0.05）。

2.2 各组心肌细胞凋亡情况比较 正常心肌组织结构排列整齐、紧密。烫伤后，心肌纤维出现扭曲、变形，间质出现充血、水肿，甚至肌纤维断裂，心肌细胞出现凋亡。给予SAHA 处理后，心肌病理变化和间质水肿较烫伤组明显减轻，心肌纤维排列较整齐。假烫组、烫伤组、SAHA 组心肌细胞凋亡率分别为0.6%±0.1%、21.5%±1.2%、15.1%±0.9%，烫伤组心肌细胞凋亡率高于假烫组，SAHA 组心肌细胞凋亡率低于烫伤组（P均＜0.05）。

2.3 各组心肌细胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO 表达比较 烫伤组心肌细胞中Caspase-3、iNOS、NO蛋白表达高于假烫组，Ac-H3K9蛋白表达低于假烫组（P均＜0.05）；SAHA 组Caspase-3、iNOS、NO 表达低于烫伤组，Ac-H3K9 表达高于烫伤组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心肌细胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO表达比较（xˉ± s）

3 讨论

严重烧伤早期，大量液体渗出，有效循环血量锐减，组织缺血，影响细胞代谢和脏器功能，直接导致心肌损伤；同时由应激反应、再灌注损伤、失控性炎症反应等，致血管内皮细胞、中性粒细胞结构和功能改变，进一步引起微循环障碍，由此加重心肌的缺血缺氧和心肌损害［7-9］。严重烧伤早期即出现心肌细胞凋亡，造成心肌不可逆损伤，是心肌损伤的病理基础。在烧伤休克早期，如果给予抗休克维持药物，提高心肌细胞对缺血缺氧的耐受能力、抑制心肌细胞凋亡，进而保护心脏功能，有助于提高患者生存率，降低后期救治难度。

伏立诺他是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，已被美国FDA批准用于皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够调节组蛋白乙酰化水平，调控基因表达。在严重烧伤及失血性休克的动物模型中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂能提高动物生存率、提高心肌内组蛋白的乙酰化修饰水平、保护心脏功能［10-12］。在大鼠心肌梗死模型中，SAHA 能抑制组蛋白去乙酰化酶活性，诱导热休克蛋白的表达，维持心肌细胞稳定［13］。在小鼠缺血—再灌注损伤模型中，SAHA 能阻止缺血—再灌注引起的心肌细胞内线粒体功能障碍和丢失［6］。

SAHA 对致死性烫伤大鼠心脏保护作用的相关研究较少。本研究建立了无静脉补液条件下致死性烫伤大鼠模型，结果显示，在大鼠致死性烫伤后，血浆CK-MB 水平明显升高，心肌纤维排列紊乱、断裂，间质充血、水肿，心肌细胞凋亡率显著升高；给予SAHA 治疗后，CK-MB 水平降低，心肌损伤及间质水肿减轻，心肌细胞凋亡率下降。这提示SAHA 能保护心肌结构完整，抑制严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡，进而保护心脏功能。

组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶通过调节组蛋白乙酰化水平，对维持细胞正常功能有重要作用。正常情况下，组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶蛋白的结构和酶活性保持高度平衡，称为乙酰化动态平衡。当机体在创伤、缺血缺氧的情况下，这种平衡被打破［14］。研究表明，在心肌梗死与缺血再灌注损伤过程中，组蛋白去乙酰化酶活性降低，而给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂后，可显著减少心肌梗死面积，减轻心脏损伤［15］。以往研究显示，Ac-H3K9 能反映心肌组织中组蛋白乙酰化水平［16］。本研究结果显示，烫伤组伤后6 h，心肌细胞中Ac-H3K9 蛋白表达较假烫组降低，而给予SAHA 处理的大鼠心肌细胞中Ac-H3K9 表达升高，表明SAHA 可能通过提高烫伤后大鼠心肌内组蛋白乙酰化水平，维持心肌细胞稳定，抑制心肌细胞凋亡，保护心脏结构。

Caspase-3 是促进细胞凋亡的重要因子，其活化后剪切PARP，使核小体间的DNA 裂解，引起心肌细胞凋亡，造成心肌细胞的不可逆损伤，进而影响心脏功能［17］。在本研究中，烫伤组伤后心肌细胞Caspase-3 蛋白表达增高，SAHA 组Caspase-3 表达较烫伤组降低，表明SAHA 有助于抑制Caspase-3 生成，从而减少心肌细胞凋亡。在心衰、心肌缺血—再灌注损伤、严重烧伤过程中，心肌细胞缺血缺氧，早期心肌细胞p53 激酶明显活化［18］，上调iNOS 表达，引起心肌细胞凋亡［19］；iNOS 高表达进一步诱导心肌细胞内NO 生成增多，NO 通过调控细胞凋亡信号通路的多个途径来促进细胞凋亡。研究表明，高水平的NO 可以直接诱发心肌细胞凋亡［20］。本研究结果显示，与假烫组比较，烫伤组在伤后心肌细胞中iNOS蛋白表达及NO 水平明显增加，而给予SAHA 处理后，iNOS、NO 水平均显著降低，提示SAHA 可能通过减少心肌细胞中iNOS蛋白表达及NO生成从而减少心肌细胞凋亡。

综上所述，SAHA 能够抑制50% TBSA Ⅲ°严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡，从而保护心脏功能。其作用机制可能与增加心肌细胞中组蛋白乙酰化水平，下调Caspase-3、iNOS蛋白表达及NO含量有关。