小分子靶标的核糖开关生物传感器研究进展

吴一凡，林晟豪，许文涛，*

1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学营养与健康系，食品精准营养与质量控制教育部重点实验室，北京100083

生物体及环境中的小分子化合物主要指辅因子、氨基酸、嘌呤、磷酸化糖、金属离子等，它们在细胞代谢、信号传导、细胞防御机制等生化过程中具有重要的作用[1]。目前，对于小分子化合物的检测技术较为成熟，主要包括色谱法、质谱法、荧光法、紫外-可见光谱法及生物传感器等。其中，生物传感器具有选择性高、成本低、操作简单、便携等优势，已经成为近年来研究的热点，拥有巨大的市场份额，且已进一步应用于合成生物学、医学等领域[2]，应用前景广阔[3]。然而在实际应用中，传统检测方法涉及到大型仪器，存在成本高、操作复杂等不足，基于酶、抗体、微生物的传感器同样存在成本高、稳定性欠佳、应用范围有限等缺点[4]。基于核糖开关（riboswitch）的生物传感器的出现为小分子检测提供了一条新途径。

核糖开关作为一种34～200 bp 的结构化的非编码核酸，位于mRNA 的5 '非编码区（5'UTR）或3'非编码区（3'UTR），可以不依赖于蛋白质发挥作用，通过与配体特异性结合，导致适体域构象改变，并将变化信号传递给表达平台域，进而调节基因表达[5-8]。早在1997 年，Gold 等[9-10]推测某些mRNA 可以直接感知小分子浓度的变化，并对这一变化做出响应。而1999 年，Gelfand 等[11]在枯草芽孢杆菌核黄素操纵子上游发现1 个可以折叠成具有5 个发夹的保守结构，这一结构被证明能够影响芽孢杆菌属中核黄素基因的表达，由此推测其可能是1 个核糖核酸调控元件。2002 年Winkler 等[12]在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现某些mRNA 能够感知代谢物从而控制基因，这是证实mRNA 表达的第1 个实验性证据，其中编码大肠杆菌中参与维生素B1生物合成酶的mRNA，可以与硫氨酸或其焦磷酸衍生物结合，而不需要蛋白质参与，因此，将此mRNA 命名为核糖开关。

目前发现的多数天然核糖开关主要存在于细菌中，迄今为止，已经发现了40 多种不同类型的细菌核糖开关[13]。此外，植物、真菌等真核生物中也存在核糖开关，主要以硫胺素焦磷酸核糖开关为主，但哺乳动物中尚未发现核糖开关[14]。

核糖开关作为一种功能核酸，具备高亲和力、高特异性、较强的可编程性、可操作性和可重复性，能够响应多种内源性小分子代谢物及非内源性小分子。因此，基于核糖开关的生物传感器具有广泛应用于小分子检测、跟踪小分子代谢物等方向的潜力。本文对核糖开关的来源、构成、调控机制、筛选，特别是对小分子靶标的核糖开关的生物传感器分类进行了介绍，旨在拓展核糖开关的新型应用领域。

1 核糖开关

1.1 核糖开关的构成与调控机制

在结构上，核糖开关由进化保守的适体结构域和可变表达平台两部分组成[15]。适体结构域高度保守，因具有高亲和力和特异性，可结合多种配体，如辅酶、金属阳离子、阴离子、核苷酸及其衍生物、氨基酸、磷酸化糖等[16]；表达平台则调节下游编码序列，控制基因表达。核糖开关的调控机制通常有3种：转录水平调控、翻译水平调控以及自身剪切作用调控[17]。

在转录水平调控中，转录终止的调节是核糖开关最常见的作用机制之一（图1A）。由一个茎和一系列尿苷残基构成了一个内在的转录终止子，导致RNA 聚合酶转录停止并释放DNA 模板和RNA 产物。而配体与适体的结合则会导致抗终止子的形成，从而控制终止子的形成[18]。Barrick 等[19]基于二级结构预测的计算方法，选取结构和解离常数已知的茶碱适体，连接下游序列，使得适体结构的30%交替成为终止子茎的一部分，设计合成茶碱核糖开关。

在翻译水平调控中，核糖开关可以通过互斥的碱基配对结构控制核糖体进入核糖体结合位点或SD（shine-dalgarno）序列，激活或者终止翻译[8]（图1B）。当核糖体结合到SD 序列上，则翻译进行；若适体与配体结合，阻止核糖体与SD 序列结合，则翻译终止[20]。Borujeni 等[21]通过统计热力学模型，对激活基因表达的翻译调节核糖开关的序列-结构-功能关系进行了预测，并利用该模型对62个合成核糖开关进行了自动计算设计。

核糖开关的另一种作用机制则是通过自身选择性剪切作用和改变mRNA 稳定性进行基因调控，这其中涉及到核酶的切割活性（图1C）。谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶GlmS 核糖开关作为其中的一种核酶，其配体为葡糖胺-6-磷酸（GlcN6P）。当GlcN6P 与核糖开关结合后，可激活核酶活性，启动降解，从而快速破坏基因的mRNA[21]。

图1 核糖开关的调控机制[23]Fig.1 The regulation mechanism of riboswitches[23]

1.2 核糖开关的筛选

1990 年，Ellington 等[22]体外筛选出与各种有机染料可以特异性结合的随机序列RNA 分子，并将其命名为“适体”。大约每1010个随机序列的RNA 分子中存在1个可以与某种小分子配体进行特异性结合的位点。体外筛选核糖开关通常以适体作为核心组件，利用配体指数级富集系统进化技术（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）筛选获得[23]。SELEX 体外筛选技术主要包括建立文库、与靶标物质孵育、洗脱分离、扩增富集等步骤[24]。迄今为止，已通过SELEX 方法筛选获得了多种适体。这一成熟的适体体外筛选方法同样适用于人工适体的核糖开关设计与筛选，具有开发出与多种小分子靶标结合的核糖开关的潜力。

理论上这些适体与天然核糖开关中的适体同样具有高亲和力和特异性结合的性质[25]。然而，仅有有限数量的适体可以最终进行核糖开关开发，如茶碱适体[26-27]、四环素结合适体[28-30]。这是由于体外筛选得到的适体无法保证体内功能[31]。

与体外筛选系统相比，体内筛选系统能够基于细胞复杂的生理环境，对进入细胞的化合物进行筛选。大多数经过体外筛选得到的核糖开关需要进一步经过体内遗传筛选后，才能够得到具有所需功能的核糖开关[32-33]。遗传筛选可以通过细胞表型鉴定细胞中生物分子的功能[34]。Nomura等[35]基于大肠杆菌，通过双重遗传选择，从75 000个克隆中成功筛选出功能性硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）核糖开关，其可以在TPP 作用下调控下游基因tet A的表达。当tet A基因在大肠杆菌中被有效表达，大肠杆菌对四环素具有耐性，但对氯化镍敏感；反之，当tet A基因不表达，大肠杆菌对四环素敏感，但对氯化镍具有耐性。

传统的遗传筛选方法虽然可以成功地筛选出具有功能性的核糖开关，但仍存在背景表达水平高、激活指数不理想等问题，因此，体内遗传筛选方法需要进一步优化。Lynch 等[36]提出了一种自动化的高通量筛选方法，该方法可以鉴定合成的核糖开关的生物活性。在缺乏所需配体的情况下，这些核糖开关显示出极低的基因表达背景水平，而在有配体存在的情况下，这些核糖开关的表达显著增加。Kirchner 等[37]利用一种高通量体内筛选系统，检测1 280个大型文库中来自炭疽杆菌的鸟嘌呤核糖开关，并鉴定出影响核糖开关介导的基因调控的配体化合物。

2 小分子靶标的核糖开关生物传感器的功能

生物传感器由分子识别元件、传感器和报告模块组成[38]。当目标分析物质通过扩散作用被分子识别元件识别后，即与分子识别元件发生特异性结合，并产生生物学信息，该信息经过传感器转换为可测量的信号，随后经过报告模块的放大和处理，最终以可视化方式显示检测结果，从而达到分析目标物质的目的[39]。生物传感器按照分子识别元件可以分为酶、抗体、细胞、微生物、脱氧核糖核酸、核糖核酸等；而生物传感器的信号输出多数为荧光、电信号以及能够直接影响宿主菌生长的抗性因子或限制因子。

近年来，核糖开关作为一种识别元件，被广泛应用于生物传感器，与传统其他传感器相比，优势更明显（表1）。核糖开关是一类功能核酸，具有可编程性、可操作性和可重复性，这使其能够依据实际需求组装拼接调控元件，并对其进行合理设计与优化。基于此，核糖开关具有识别特定的代谢物（如包括辅因子在内的多种配体、嘌呤及其衍生物、氨基酸、磷酸化糖和金属离子[40]）和扩大可检测配体多样性的潜力。基于核糖开关的生物传感器，最常见的信号输出系统为蛋白质水平的报告系统，如绿色荧光蛋白及其变体[41]等；同时，还存在一类荧光核酸适体也可以作为报告剂使用，如菠菜适体[42-46]、花椰菜适体[47]及芒果适体[48]。此外，也可以通过使用抗生素抗性的基因进行生长依赖性分析，如通过四环素抗性基因tetA进行阴性或阳性的选择[49]。

表1 不同类别生物传感器的特点Table 1 The characteristics of different types of biosensors

2.1 辅因子

2.1.1 硫胺素焦磷酸 硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）作为碳水化合物和氨基酸代谢中各种代谢中间产物羧化和脱羧的必要辅因子。TPP 核糖开关是最普遍且丰富的一种核糖开关，同样也是唯一在真核生物中存在的核糖开关，包括真菌[50-51]、藻类[52]和植物[53]。其可以参与调节TPP 的基因表达，从而在转录和翻译水平上调节mRNA 衰减、Rho 依赖性转录终止、交替剪接[54]。Aghdam 等[55]比较了来源于Alishewanella tabrizica、Alishewanella aestuarii、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的TPP适体结构域，对其亲和力进行分析，最终证明Alishewanella tabrizica、Alishewanella aestuarii的TPP 结合亲和力最高，是功能性的TPP 核糖开关。此外，TPP 核糖开关还可以作为抗菌药物靶点。Pavlov 等[56]基于生物信息学分析，根据核糖开关作为抗菌药物靶点的适宜性对其进行分组，研究得到TPP 可作为抗菌药物靶点，抑制TPP 核糖开关将阻碍某些致病菌的生长。

2.1.2 S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）SAM 作为生物体内重要的代谢产物，是由甲硫氨酸和ATP 通过SAM 合成酶合成的。SAM 在细胞代谢中发挥至关重要的作用，是已知最常见的核糖开关效应因子[57]。作为已知最大的核糖开关组，SAM核糖开关已经确定了SAM-Ⅰ超家族、SAM-Ⅱ超家族、SAM-Ⅲ家族，这3个不同的SAM 核糖开关超家族是自然界中最常见的核糖开关类别，在某种程度上构成了结构化核糖核酸的整体。Tang 等[58]通过体内外研究表明，野油菜黄单胞菌中SAM-ⅠXcc核糖开关在黄单胞菌中高度保守，具有双重功能表达平台，主要在翻译水平上利用Met 操纵子调节甲硫氨酸的合成，以响应细胞中SAM水平。

2.2 嘌呤及其衍生物

嘌呤核糖开关于2003 年被发现，是最具特征的核糖开关之一。这类核糖开关可以分为4 类，分别与腺嘌呤、鸟嘌呤、脱氧鸟嘌呤核苷和3类高度修饰的鸟嘌呤（prequeuosine，preQ1）结合[59]。其中，腺嘌呤和鸟嘌呤核糖开关尽管结合不同的代谢物，且具有不同的基因表达调控机制，但是其适体结构域具有高度的结构相似性，结合口袋几乎相同[60]。

在多种核糖开关中，add 型腺嘌呤核糖开关是结构最简单的核糖开关之一[61]。腺嘌呤核糖开关是目前罕见的具有激活基因表达作用的核糖开关[62]。对于腺苷敏感的创伤弧菌（Vibrio vulnificusadd）核糖开关，其与配体结合时可以调控腺嘌呤脱氨酶翻译的启动；反之，若缺乏腺嘌呤，则会形成茎环结构阻止SD 序列与核糖体结合以抑制翻译起始[63]。

鸟嘌呤核糖开关分布广泛，主要存在于金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等革兰氏阳性菌基因中[64]。其结合口袋可以识别配体小分子，通过局部构象变化以及Watson-Crick 碱基配对的相互作用，从而将配体完全包裹在内[65]。与腺嘌呤核糖开关的基因表达调控机制相反，鸟嘌呤核糖开关作为一种负反馈调节机制，通过抑制基因的表达从而对细菌病原体代谢和运输进行调控。因此，鸟嘌呤核糖开关被认为具有成为新型抗菌化合物的潜力。Kim 等[66]研究发现，鸟嘌呤类似物G7 可以抑制枯草芽孢杆菌中由鸟嘌呤核糖开关调控的报告基因的表达，表明G7可能通过调控鸟嘌呤核糖开关进而抑制细菌生长。Yan 等[67]通过测量鸟嘌呤类似物对艰难梭菌（Clostridium difficile）中的鸟嘌呤核糖开关的亲和力以及其结构-活性的关系，发现鸟嘌呤核糖开关能够调节嘌呤化合物的基础代谢，进而确定了鸟嘌呤核糖开关几种鸟嘌呤类似物的抗菌活性。

2.3 氨基酸

在目前发现的40 类核糖开关中，仅3 种核糖开关可以调节遗传编码的氨基酸浓度，分别为甘氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺。其中1 个重要的调节途径涉及到赖氨酸核糖开关，其可指导赖氨酸自身以及赖氨酸和其他氨基酸前体物质的生物合成和运输[68]。赖氨酸是所有生物的必需氨基酸，因此其生物合成途径具有至关重要的意义。Mukherjee 等[69]通过对所有原核生物中赖氨酸核糖开关的分布进行基因组学和系统发育学分析，发现赖氨酸核糖开关在厚壁菌门和γ变形菌中分布最为丰富，并揭示了通过核糖开关进行赖氨酸调控的模式，其主要存在于生物合成基因的上游，这有利于未来将核糖开关运用于靶向治疗。

2.4 磷酸化糖

GlmS 核糖开关广泛存在于革兰氏阳性菌中，其作为1 种位于GlmS基因的5'非翻译区的自剪切核酶，可以催化GlcN6P的合成[70]。GlcN6P是细菌细胞壁的重要组成部分，当GlcN6P 与GlmS 核糖开关结合后，可以诱导GlmS核糖开关发生自剪切，抑制下游基因表达，进而导致mRNA 的不稳定，由此形成不稳定的细胞壁，限制了细菌的生长[71-73]。因此，GlmS 核糖开关同样具有开发针对各种病原菌药物的潜力。Luense 等[72]发现了1 种新的GlcN6P的碳类似物，可以激活金黄色葡萄球菌中的GlmS 核糖开关，其效力与天然GlcN6P 相同，但仅在高浓度下诱导的GlmS核糖开关发生自剪切，从而发挥抗菌作用。

2.5 金属离子

金属离子作为多种酶的辅因子，在生物学中发挥至关重要的作用。然而，当细胞内金属离子浓度超过一定阈值，细胞毒性也随之增加[74]。因此，细胞内的金属离子需受到严格的调节。除了多数细菌通过非编码核糖核酸进行反式作用调节外，研究表明，某些细菌可以利用顺式调控作用RNA 元件核糖开关调控金属离子稳态，其中，Mg2+核糖开关是最常见的[75]。Dann 等[76]在枯草芽孢杆菌中发现了一个参与Mg2+调控的金属感应核糖开关，命名为M-box，其可发挥关闭开关的作用，当Mg2+与Mg2+核糖开关的适体结构域结合时，下游基因内会形成转录终止子，这可能是调控细菌中金属离子水平的一种常见模式。此外，还存在Ni2+、Co2+、Mn2+核糖开关，这种核糖开关及其天然配体分布于多种细菌中，可能作为相应金属离子毒性浓度的传感器[13]。

2.6 其他小分子

除上述涉及的几类小分子化合物，目前所发现的最为显著的核糖开关之一是氟化物核糖开关。2010 年，Weinberg 等[77]在细菌和古细菌中发现1 种结合配体未知的核糖开关。随后，Baker等[78]发现这一类核糖开关可以选择性地结合氟化物，激活编码氟化物运输工具、被氟化物抑制的酶及其他蛋白质的基因表达，进而减轻自然界中氟离子的有害影响。因此，根据这一作用机制，可以有效检测和控制氟离子的毒性水平。

3 展望

自2002 年初次发现核糖开关以来，其作为一种新型调控基因表达的方式已经近20 年，在基因表达的调节中发挥至关重要的作用。合成核糖开关是极具前途的工具，目前已将其应用于代谢工程、合成生物学等领域。基于小分子靶标的核糖开关的生物传感器具有多种优势，是检测小分子的有力工具，我们在核糖开关的筛选、裁剪、理性设计等几个方向提出以下展望。

①开发核糖开关的高通量筛选及裁剪系统。核糖开关未来可以通过高通量筛选的方法，进一步开发更多的核糖开关，与此同时，通过裁剪进一步提高核糖开关的识别特异性及亲和力。

②体外筛选核糖开关的体内环境适用性改造。经过体外筛选所得的适体，仅有少数核糖开关能保证在细胞内性能和功能的稳定性，未来可以通过高通量自动化体内筛选技术，辅以计算机等新型手段，有望突破传统遗传筛选与体外筛选的局限性。

③核糖开关的计算机辅助理性设计。现阶段对于设计核糖开关的方法还未完全了解，计算辅助热力学建模仍存在一定局限性，未来可以进一步开发更有效的方法进行计算设计与优化。

④核糖开关识别与发光功能核酸信号输出的有机整合。目前核糖开关信号输出主要以荧光蛋白和荧光核酸适体为主，未来可以进一步丰富核糖开关的信号输出系统。

⑤核糖开关无细胞传感器开发。目前已有研究表明，无细胞传感器使得核糖开关小分子靶标的出入细胞器不受限制[79]，具有极易调节反应环境的关键优势，同时具备便携、低成本、操作简便、可以长期储存等特性，这对于未来针对小分子靶标的快速检测具有极大的应用潜力。