指状青霉V-ATP酶H亚基蛋白的功能

闫 等，彭丽桃，李 杰，杨书珍

（华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070）

柑橘是世界和我国第一大类水果，其种植面积和产量均具世界前列，柑橘产业是南方农村经济发展的支柱产业[1]。但柑橘果实含水量高，营养丰富，在采后贮运、加工过程中极易遭受病原真菌的侵染而腐烂变质，其中指状青霉（Penicillium digitatum）的侵染性最强，对柑橘的危害最为严重，给生产带来巨大的损失[2-4]。化学杀菌剂处理是目前生产上控制柑橘采后侵染性病害的主要方法，但随着化学杀菌剂在生产中长期、大量使用，指状青霉对化学杀菌剂的抗药性大幅度提高。由此产生的食品安全、农药残留、环境污染等问题严重限制了柑橘产业的健康发展[5-7]。因此，研究与开发具有新型、高效、低耐药性的杀菌剂对柑橘产业的健康发展具有重要意义。

分子生物学的发展开启了“靶点-高通量筛选-先导物优化”揭示的现代药物发现模式。作用靶点是研发新型杀菌剂的前提。通过解析生物体生命代谢通路中关键蛋白和基因的功能，从中筛选有效作用靶点已经成为研发新型多靶点药物的重要途径。pH值稳态系统是维持真菌细胞内环境稳定，保证细胞代谢与生理功能正常的重要前提[8]。pH值稳态系统的破坏显著抑制白色念珠菌的生长[9]，影响球孢白僵菌细胞骨架的维持[10]；此外，pH值稳态系统与病原真菌侵染寄主的过程密切相关。越来越多的研究发现，细胞内几乎所有蛋白质和各细胞器功能的行使、物质代谢、氧化应激、离子稳态、细胞分化、内吞作用以及侵染寄主等生命过程均离不开细胞内pH值的精准调控，是发现新型药物靶点的重要途径[11]。V-ATP酶是调控真核细胞pH值稳态的关键酶，广泛分布于真菌和其他真核细胞的液泡、质膜、内质网膜以及高尔基体等内膜系统中，负责将H＋从细胞液跨膜运输到各细胞器中，维持细胞内膜系统pH值稳态[12]。V-ATP酶是一个由多亚基组成的复合物，主要由V1和V0两个结构域组成。其中，V-ATP酶H亚基蛋白（V-ATPase membrane subunit H，VMAH）主要负责调控复合体V1和V0的组装以及通过水解ATP调控H＋的跨膜运输[13-14]。酿酒酵母细胞中VMAH的缺失会导致菌体出现致死现象[15]。在球孢白僵菌中VMAH功能缺失会导致菌体细胞pH值稳态系统和Ca2＋稳态系统的破坏[10]。前期研究也发现，VMAH是指状青霉V-ATP酶的关键亚基蛋白，在病原菌生长和侵染过程中发挥着重要作用。此外，VMAH亚基蛋白的蛋白结构和氨基酸序列真菌特异性强，作为新型杀菌剂作用靶点具有潜在的研究前景[16]，因此，在前期研究的基础上，进一步利用RNA干扰技术和基因过表达技术，研究VMAH在指状青霉生长过程中的生理功能以及作为抑制柑橘绿霉病的药物作用靶点的可行性，为研发适合柑橘采后防腐保鲜的杀菌剂提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生型指状青霉菌株WT（菌株编号：DSM62840）德国微生物菌种保藏中心；VMAH沉默和过表达指状青霉突变株si14和oe12，实验室分别利用RNA干扰技术和过表达技术获得。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，加入1 L蒸馏水，煮沸后取滤液加入蔗糖10 g，琼脂20 g，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min；马铃薯葡萄糖液体（potato dextrose broth，PDB）培养基：马铃薯200 g，加入1 L蒸馏水，煮沸后取滤液加入蔗糖10 g，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

质子泵抑制剂类杀菌剂联苯苄唑、酮康唑、奥美拉唑、泰妥拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、巴佛洛霉素A1、依布硒、克霉唑（除克霉唑纯度大于99%外，其他纯度均大于98%） 上海麦克林生化科技有限公司；NaCl、KCl、CaCl2、CuCl2、FeSO4、MgSO4、H2O2（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-150BIII生化培养箱 北京鑫润科诺仪器仪表有限公司；EX20Thermo Fisher显微镜 宁波舜宇仪器有限公司；SHZ-82A气浴恒温振荡器 江苏省金坛市宏华仪器厂；LGJ-10冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正常生长环境下指状青霉菌丝生长特性评价

参考菌饼法[17]稍作修改，取在PDA培养基上26 ℃培养3 d的野生、沉默、过表达指状青霉孢子，制成1×106spores/mL孢子菌悬液，吸取200 μL孢子悬浮液均匀涂布于PDA培养基中，培养至产生白色菌丝后，用7 mm打孔器打取菌饼，将菌饼反贴于PDA培养基，于（26±2）℃的生化培养箱中培养，每隔24 h采用十字交叉法测定病原菌的菌落直径。

1.3.2 不同酸碱环境下指状青霉生长特性评价

取在PDA培养基上26 ℃培养3 d的野生、沉默、过表达指状青霉孢子，制成1×106spores/mL孢子菌悬液，取100 μL孢子悬浮液接种于含50 mL pH值分别为2、4、6、8、10的PDB培养基中，透气膜封口并摇匀，置于恒温摇床中（26±2）℃、120 r/min培养48 h。拍照观察菌丝形态；然后用纱布过滤取菌丝，用蒸馏水冲洗2 次，滤纸吸干表面水分后冷冻干燥机上干燥48 h，分析天平记录菌丝干质量，菌丝干质量表示菌体生物量。

1.3.3 不同离子胁迫环境下指状青霉生长特性评价

参考1.3.1节采用菌落反贴的方法研究VMAH沉默对指状青霉离子胁迫环境适应性的影响。将生长状态一致的野生型、沉默和过表达指状青霉的7 mm菌落，分别反贴至含有不同浓度的NaCl、KCl、CaCl2、CuCl2、FeSO4、MgSO4的PDA培养基中，置于26 ℃恒温培养箱培养并定期观察。以正常PDA培养为空白对照。每个菌株设置3 个重复，培养7 d，采用十字交叉法测定菌落直径。按下式计算不同胁迫条件对菌落生长的相对抑制率：

1.3.4 活性氧胁迫环境下指状青霉生长特性的评价

将生长状态一致的野生型、沉默和过表达指状青霉的7 mm菌落，分别反贴至含有不同浓度H2O2的PDA培养基中，置于26 ℃恒温培养箱培养并定期观察。以正常PDA培养为空白对照。每个菌株设置3 个重复，培养7 d，采用十字交叉法测定菌落直径。计算其不同胁迫条件对菌落生长的相对抑制率。

1.3.5 指状青霉对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性评价

利用孢子萌发法[18]研究VMAH基因沉默对指状青霉质子泵抑制剂敏感性的影响。用二甲亚砜分别配制不同质子泵抑制剂的母液，通过二倍稀释法将药物稀释成不同系列浓度，取10 µL各药液与5 mL 0.5%的PDA培养基混匀后，均匀铺在载玻片上，培养基凝固后，分别吸取40 μL浓度为1×106spores/mL野生、沉默、过表达指状青霉孢子悬液滴在载玻片的培养基上，（26±2）℃恒温培养箱中培养12 h左右，观察孢子萌发的情况，统计孢子萌发数量，计算孢子萌发率和抑制率，以药物质量浓度为横坐标，孢子萌发抑制率为纵坐标，根据药物毒力回归方程计算药物抑菌的半最大效应浓度（the median effective concentration，EC50）[19]。

1.4 数据处理

用Excel软件进行数据处理和作图，所有数据均为3 次重复所得，分析采用SPSS 23软件对实验数据进行单因素方差分析，应用最小显著差数法检验差异显著性（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 VMAH沉默和过表达对正常条件下指状青霉菌丝生长特性的影响

由图1A可知，与同时期的野生株相比，基因沉默株的生长势明显变弱，产孢量显著降低；而过表达株的生长势强于野生株，菌落直径和产孢量均大于野生株。进一步测定菌丝体的生长曲线（图1B）发现，在整个培养过程中，基因沉默株si14的菌落直径始终小于野生株；而过表达株oe12的菌落直径大于野生株。因此，沉默VMAH抑制了指状青霉的生长，而过表达VMAH促进了指状青霉的生长。

图1 VMAH基因对指状青霉菌丝生长的影响Fig. 1 Effect of VMAH gene on the growth of P. digitatum hyphae

2.2 VMAH沉默和过表达对不同pH值环境下指状青霉生长特性的影响

图2 VMAH基因对指状青霉pH值适应性的影响Fig. 2 Effect of VMAH gene on pH adaptability of P. digitatum

如图2所示，WT、si14和oe12的菌丝对偏酸和偏碱条件比较敏感，在pH 10的培养基中，菌丝均不生长。在pH 2的培养基中，过表达和野生菌株都有少量的菌丝生长，无明显成球的菌丝体，沉默菌株的菌丝量相对更少，菌丝分散。在pH 8的培养基中，WT、si14和oe12都可以看到球状菌丝，而沉默菌丝球体积较小，呈米粒状，整体密度不大，分散比较明显；野生型相对于沉默菌株，其菌丝球体积偏大，在培养基中分布也比较均匀，密度适中；过表达相对于前者，其菌丝球体积最大，而且菌丝球致密且规则。同时，在不同pH值环境下，沉默菌株的生物量显著低于野生株，在pH 2和pH 8时差异更为显著；而过表达株的生物量显著高于野生株，在pH 6时差异最为显著。

2.3 VMAH沉默和过表达对不同离子胁迫条件下指状青霉生长特性的影响

图3 VMAH基因对指状青霉离子胁迫环境适应性的影响Fig. 3 Effect of VMAH gene on environmental adaptability of P. digitatum to ion stress

如图3所示，在6 种金属离子的胁迫环境下，沉默突变株si14对高浓度的Ca2＋、Fe2＋、Cu2＋比较敏感，对Na＋、K＋、Mg2＋不敏感，其中，沉默突变株对高浓度Ca2＋敏感度最高，当Ca2＋达到1 mol/L时，其菌丝的相对抑制率可达90%左右，而且抑制率显著高于野生型和过表达菌株。过表达菌株对高浓度的Cu2＋比较敏感，对其他5 种金属离子不敏感。其中，低浓度的Ca2＋对过表达菌株起轻微促进作用。

2.4 VMAH沉默和过表达对指状青霉H2O2胁迫环境的影响

图4 VMAH基因对指状青霉H2O2胁迫环境的影响Fig. 4 Effect of VMAH gene on the response of P. digitatum to H2O2 stress

如图4所示，用不同浓度的H2O2处理后，其生长状况受到不同程度的抑制，菌落直径随着H2O2浓度的增大不断减小，并且菌丝的产孢量也不断下降，菌落形态没有发生明显变化。从菌丝生长的相对抑制率可以看出低浓度H2O2对野生菌株和沉默菌株的抑制作用较小，无显著差异，而对过表达菌株的相对抑制率较高。随着H2O2浓度的增大，菌丝生长的相对抑制率不断增大，当其浓度为40 mmol/L时，沉默菌株对H2O2更为敏感，其菌丝生长的相对抑制率显著大于野生株，而过表达菌株的相对抑制率明显小于野生菌株和沉默菌株。

2.5 VMAH沉默和过表达对指状青霉质子泵抑制剂敏感性的影响

表1 VMAH基因对指状青霉质子泵抑制剂抑菌EC50的影响Table 1 Effect of VMAH gene on the median effective concentration(EC50) of proton pump inhibitors against P. digitatum

通过孢子萌发法研究VMAH基因沉默后指状青霉对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性。本研究选取了包括唑类在内的9 种质子泵抑制剂，由表1可见，相比于野生株，沉默菌株对于除依布硒之外，其他7 种质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性都显著提高；其中沉默菌株对V-ATP酶的专一抑制剂巴佛洛霉素A1的敏感性提高最为显著，其EC50为10.44 µg/mL，仅为野生株EC50（80.11 µg/mL）的13%。过表达菌株对质子泵抑制剂的敏感性显著降低，其中巴佛洛霉素A1的敏感性下降最为显著，其EC50值为172.08 µg/mL，是野生株的2 倍。因此，沉默VMAH基因显著提高了指状青霉质子泵类抑制剂的敏感性，尤其是对巴佛洛霉素A1的敏感增加最多；而过表达VMAH基因显著降低了指状青霉对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性。

3 讨论与结论

V-ATP酶在真菌生长发育过程中发挥重要作用。Keenan等[15]在酿酒酵母突变菌株中发现，V-ATP酶中游离V1复合体H亚基的缺失会出现致死现象。丝状真菌Ashbya gossypii Vma1基因缺失突变株的生长速率下降，并且无法形成生殖孢子[20]。白色念珠菌的Vma5亚基缺失突变株也出现菌丝发育缺陷、生长抑制以及毒力减弱等表征[21]。Lin Meng等[22]发现VMAH功能缺失会影响酿酒酵母液泡内营养物质的贮存和稳定，进而影响酵母丝状体的形成，导致其生长速率慢于野生型。球孢白僵菌中也有类似发现，VMAH基因缺失的突变株，产孢量下降，产孢时间延长，同时出现相当程度的生长缺陷及致病力的减弱[23]。本研究发现，VMAH基因沉默的转化子，菌丝生长速率明显下降，产孢量也显著减少。因此，VMAH在指状青霉生长发育过程中发挥着关键作用。

V-ATP酶参与调节细胞内的pH值应答，在维持细胞内外pH值平衡中发挥着重要的作用。VMAH基因敲除后会导致球孢白僵菌液泡pH值显著升高，菌丝生长环境酸化加快，胞内外pH值失衡[23]。光滑念珠菌的VMAHVPH2基因缺失突变株的液泡pH值稳态受损，对碱性条件较为敏感[24]。Martinez-Munoz等[25]研究发现VMAH基因突变会导致酵母菌液泡pH值的显著增加，pH值稳态遭到破坏。白念珠菌V-ATP酶亚基Vma7p缺失后，菌体液泡酸化度降低，在碱性条件下生长有一定缺陷[26]。而本研究发现，VMAH基因沉默突变显著降低了指状青霉在极酸（pH 2）和偏碱（pH 8）条件下的生长力，菌丝生长量显著减少。因此，VMAH通过调控V-ATP酶活性，在指状青霉pH值胁迫条件下pH值稳态的维持中发挥重要作用。

V-ATP酶在维持真核生物的离子稳态和氧化应激方面也发挥着一定作用[27-28]。酿酒酵母中V-ATP酶缺失突变株对金属离子和H2O2比较敏感，与胞质高度酸化和活性氧增加有关[29]。Jia Chang等[30]研究发现白色念珠菌V-ATP酶亚基Tfpl缺失突变株对重金属离子和高浓度的Ca2＋高度敏感，突变株细胞内活性氧水平升高。光滑念珠菌中V-ATP酶组装相关基因VPH2缺失的突变株对胞外高浓度Ca2＋、Na＋等离子和氧化剂H2O2的敏感性增加[31]。Zhang Kai等[21]研究也发现，白色念珠菌的Vma5亚基缺失，不仅影响菌丝的形成和降解酶的分泌，还导致钙稳态紊乱，Ca2＋相关的氧化应激反应受到抑制。通过研究指状青霉VMAH基因沉默突变株对于金属离子和氧化剂H2O2胁迫的敏感性发现，VMAH沉默突变株对胞外高浓度的Ca2＋、Fe2＋、Cu2＋和氧化剂H2O2的敏感性较高，尤其是高浓度的Ca2＋对突变株抑制作用较显著。推测突变体对金属离子的高度敏感性与维持离子稳态的缺陷有关，这些金属离子稳态失衡可能进一步引起内源氧化应激，从而对氧化剂H2O2比较敏感，表明VMAH通过调控V-ATP酶活性在维持细胞离子稳态、活性氧水平和氧化应激方面起重要的作用。

研究发现环境pH值影响病原菌对抗生素的敏感性[32]。编码光滑念珠菌V-ATP酶组装的VPH2基因的缺失，会增强对抗真菌剂（唑类和两性霉素B）的敏感性[24]。Zhang Yongqiang等[33]发现抗真菌药物的唑类化合物通过抑制细胞膜脂组分甾醇的合成和V-ATP酶的活性进而引起菌体细胞的死亡。位于细胞膜的P-ATP酶亚基Spfl的缺失会提高菌体对氟康唑、衣霉素和潮霉素B敏感性[34]。酵母菌V-ATP酶亚基a的突变体对巴佛洛霉素具有抗性[35]。本研究发现VMAH基因沉默对导致菌体对质子泵抑制剂类杀菌剂尤其是V-ATP酶的专一性抑制剂巴佛洛霉素A1的敏感性提高，而过表达突变株对质子泵抑制剂的敏感性降低。因此，VMAH与质子泵类杀菌剂具有协同杀菌作用，是多靶点杀菌剂研发的潜在药物靶点。

综上所述，VMAH在指状青霉的生长、pH值和离子稳态系统的维持、活性氧水平和氧化应激方面发挥着重要作用，作为控制柑橘采后绿霉病杀菌剂的作用靶点值得进一步深入研究。