麻醉对肺缺血再灌注损伤大鼠认知功能的影响

2022-03-30 02:03夏若馨刘天豪张从利张引刘刚李晓红张阳
锦州医科大学学报 2022年1期
关键词:预处理麻醉记忆

夏若馨,刘天豪,张从利,张引,刘刚,李晓红,张阳

(1.蚌埠医学院;2.蚌埠医学院第一附属医院麻醉科,安徽 蚌埠 233000)

肺缺血再灌注损伤是由于机体组织或器官在缺血再灌注后导致的肺组织迅速损伤,其原因与氧化应激、细胞内钙超载、促炎介质释放、白细胞活化、蛋白酶释放等病理生理反应有关,可引发肺泡上皮细胞和肺毛细胞血管内皮细胞受损,且由于炎性介质大量释放,还极有可能导致术后认知功能障碍[4]。

目前临床上主要通过麻醉类药物减轻LIRI,如七氟烷对器官的缺血再灌注损伤的保护作用在心肌[5]、脑[6]、肝脏[7]、肾脏[8]、肠道[9]等均得到验证,且有相关研究表明其对 LIRI 也具有保护作用,但具体保护机制仍有待进一步探讨[10]。因此本文利用肺缺血再灌注损伤大鼠模型,就麻醉对其所致术后认知功能的影响进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 肺缺血再灌注损伤大鼠模型制备

选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠共30只,初始体重控制在300 g左右,由蚌埠医学院实验动物中心提供。编号为20201723,适应环境1 w,饲养温度23~25 ℃,自由饮水摄食。采用随机数字表法,将大鼠随机分为3组(n=10)。假手术组(S组):大鼠进行腹腔注射麻醉后仰卧位固定,游离大鼠气管,行气管插管术,接小动物呼吸机行机械通气30 min后,大鼠行右侧卧位,并在大鼠左侧第5肋间进胸,游离左肺门,并用生理盐水浸泡过的湿纱布覆盖所暴露的肺组织制备S组模型;肺缺血再灌注组(I/R组):采用同S组模型同样模型制备方法对大鼠肺组织进行暴露,阻断左肺门45 min,松开血管钳形成肺缺血再灌注模型;七氟烷(日本 Maruishi Pharmaceutical 公司生产)预处理组(SP组):使大鼠吸入2.1%七氟烷30 min,洗脱10 min,阻断左肺门45 min,形成再灌注时立刻再次吸入2.1%七氟烷30 min,以此制备七氟烷预处理模型[11],见图1。

图1 肺模型(左),肺缺血再灌注大鼠模型制备图

1.2 大鼠空间学习与记忆能力测定

通过Morris水迷宫测定。水迷宫通常由圆形水池(直径1.5 m)、平台(直径10 cm)、自动摄像机及电脑分析系统组成。测试前注水,控制水深30 cm,水温在22 ℃左右,水中滴加墨汁使水不透明。将水池平均划分为4个象限,将平台置于其中一个象限的中央[3]899-903。

1.2.1 逃避潜伏期(escape latency period)实验:术后第3天开始,将大鼠头朝池壁随机取每个象限的中点处放入水中[12]。观察在120 s内大鼠的游泳轨迹,并记录大鼠找到平台的时间,如在规定时间内大鼠未找到平台,则使其在平台上停留30 s以建立记忆训练[12]。每只动物在每天相同时间点训练4次,两次训练时间间隔为15~20 min,连续进行5 d[3]899-903。

1.2.2 空间探索实验:隐藏平台实验结束后撤除平台,将动物由原先平台象限的对侧放入水中,计时60 s,观察大鼠的穿台次数和在各象限的游泳时间比[12]。

1.3 蛋白免疫印迹(Western Blot)

上述行为学实验结束后,即刻麻醉大鼠断头取脑组织及肺组织。并在冰上迅速分离海马组织(用于检测TREM2),与肺组织(用于检测p-GSK-3β)分别分装于几个1.5 mL EP管中,一起于液氮中速冻,-80 ℃保存,以备Western Blot检测。分别取1管冷冻组织,准确称重,用RIPA蛋白裂解液提取蛋白,按重量比加入裂解液,冰浴中匀浆,4 ℃ 12 000 rpm/min离心30 min以去除组织碎片,BCA 法测定蛋白浓度。电泳、转膜、封闭、洗脱后分别相继加入TREM2、p-GSK-3β及GAPDH的一抗及二抗(抗体购自Cell Signaling公司,美国)进行免疫反应,用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)检测蛋白表达情况[3]899-903。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 七氟烷预处理对肺缺血再灌注大鼠学习记忆能力的影响

经训练后的3组大鼠逃避潜伏期均有所缩短,与S组相比,I/R组逃避潜伏期有明显延长,表明I/R组大鼠记忆受损明显,与I/R组相比,SP组逃避潜伏期有较明显的缩短,表明七氟烷预处理对大鼠记忆损伤有一定的改善作用,见表1。

在空间探索实验中,与S组相比,I/R组穿越原平台位置的次数明显减低,且运动轨迹紊乱;与I/R组相比,SP组穿台次数明显增多,但与S组相比,其穿台次数明显降低,且运动轨迹较I/R组大鼠明显集中于原平台附近。上述两组均具有统计学差异,分别为P<0.001和P<0.05,见表2。表明撤除平台后,S组及SP组均对原平台有较好的空间记忆。3组大鼠的游泳轨迹,见图2。以上结果表明,I/R组和SP组大鼠空间记忆都明显受损,但SP组大鼠在一定程度上保留了对原平台的空间记忆。

表1 各组大鼠的逃避潜伏期

表2 各组大鼠的穿台次数

图2 大鼠游泳轨迹图

2.2 七氟烷预处理影响大鼠模型TREM2的表达

有研究表明,TREM2 与认知功能和炎症反应有关。为进一步研究麻醉预处理对肺缺血再灌注大鼠认知功能的影响,通过Western Blot方法检测大鼠模型海马组织TREM2的表达,结果表明,与S组相比,I/R组和SP组其表达都有所下降,但SP组与I/R组相比有所上调,见图3A。上述结果提示七氟烷预处理可能通过抑制TREM2的下调改善大鼠的认知功能损害。

2.3 七氟烷预处理影响大鼠模型p-GSK-3β的表达

GSK-3β可通过磷酸化下游底物而发挥生物学作用,有研究表明,其抑制剂可通过抑制蛋白络氨酸包括粘着斑激酶的活化抑制炎症反应以保护肺。因此本研究通过对提取大鼠肺组织蛋白质,进行Western Blot,检测p-GSK-3β的表达,与S组相比,I/R组和SP组p-GSK-3β表达减少,而SP组可在一定程度上增加GSK-3β自身磷酸化,见图3B。实验表明,七氟烷预处理可在一定程度上通过上调GSK-3β的磷酸化从而减轻再灌注损伤。

A:TREM2在3组大鼠海马组织的表达水平;B:p-GSK-3β在3组大鼠肺组织的表达水平

3 讨 论

肺缺血再灌注损伤与患者预后密切相关,常发生在体外循环术后、心肺手术术后等,目前 LIRI 仍然是临床上亟待解决的难题[11]。术后认知功能障碍是麻醉手术后常见的中枢神经系统并发症[13]。有研究表明七氟烷对 LIRI 具有保护作用,但具体机制尚未完全阐明,因此研究七氟烷对 LIRI 的保护机制及相关靶点为临床研究奠定实验基础,同时对改善患者预后也有重要的现实意义。

本研究中我们通过构建肺缺血再灌注损伤大鼠模型,利用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力,潜伏期的长短代表学习能力的强弱;通过空间探索实验用来检测大鼠记忆保留的能力,大鼠的穿台次数和运动轨迹与记忆是否受损有关[3]899-903。本实验发现,3组大鼠模型的游泳速度没有差异,在运动过程中前肢平展,两爪靠近,因此可排除由前肢运动功能缺陷造成的记忆影响。与假手术组相比,肺缺血再灌注组和七氟烷预处理组大鼠的潜伏期有所延长,而在平台区域的停留时间和穿梭次数都有所下降,表明肺缺血再灌注手术可能会对认知功能造成一定损伤;与肺缺血再灌注组相比,七氟烷预处理组大鼠的潜伏期有所下降,而在平台区域的停留时间和穿梭次数都有所增加,表明七氟烷预处理可对大鼠的记忆功能有一定的保护作用。

LIRI的发病机制较为复杂,目前研究表明术后局部组织炎症因子风暴是造成肺缺血再灌注损伤的主要原因之一[14]。TREM2是一种跨膜受体,免疫球蛋白超家族成员之一,有研究表明,TREM2 上的变异体R47H 与多囊性脂膜样骨发育不良并硬化性白质脑病(nasu hakola disease,NHD)和阿尔茨海默症(alzheimer’s disease,AD)患病有关[15-16]。敲除TREM2可通过上调肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor -α,TNF -α)、IL-6 等加重认知功能损害[17-18]。本研究中检测了术后大鼠海马组织的TREM2表达水平,结果表明,与S组相比,I/R组和SP组其表达都有所下降,但SP组与I/R组相比有所上调,且大鼠空间记忆学习能力有所恢复,表明七氟烷预处理有可能改善大鼠的认知功能损害。

GSK-3β为丝氨酸/酪氨酸家族成员,在细胞内通常呈活性状态,通过磷酸化下游底物而发挥生物学作用,参与细胞生存、凋亡等重要功能的调节[19]。近来大量研究表明,在心、脑、肝、肾等重要器官缺血再灌注损伤模型中,其在抗缺血再灌注损伤过程中发挥着重要作用[20-23]。本研究中,与S组相比,I/R组和SP组p-GSK-3β表达减少,而SP组可在一定程度上增加GSK-3β自身磷酸化,从而减轻再灌注损伤。

综上所述,本研究以肺缺血再灌注大鼠为模型,通过水迷宫实验和检测炎症相关蛋白TREM2、GSK-3β探讨麻醉预处理对术后认知行为的影响,结果表明七氟烷可以改善肺缺血再灌注损伤大鼠的认知功能,为临床研究提供了理论依据。

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