AHP-CRITIC法结合正交设计优选复方丹参方中丹参与三七的水提工艺

雷芳，伍丹情，费清松，罗芮，何宁，2，3，4*（.安徽中医药大学药学院药剂系，合肥 23002；2.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，合肥 23002；3.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，合肥 23002；4.现代药物制剂安徽省工程技术研究中心，合肥 23002）

复方丹参方是上海中药二厂于1977年研制成功并投产的经典名方，由丹参、三七和冰片三味中药组成，具有活血通络、理气止痛的功效，临床可用于治疗心脑血管相关疾病。目前，复方丹参方已有六种剂型收载于2020年版《中国药典》，复方丹参滴丸更是全球首例完成美国FDAⅢ期临床研究（NCT01659580）的中药复方制剂，临床治疗心绞痛、冠心病有很好的疗效。除了剂型和丹参量的不同，制剂过程中丹参、三七提取工艺造成的活性组分差异性也会影响疗效。丹参水溶性成分的药效远高于其脂溶性成分，近年来丹参水溶性成分治疗心血管疾病的潜力被慢慢发掘，臣药三七与之合煎时有助于丹参成分溶出和含量稳定，因此研究复方丹参方中丹参和三七合提时的水提工艺是十分有意义的。

复方丹参方的药效物质基础为亲脂性二萜类、亲水性酚酸类及三七皂苷三大类化合物。丹参素是丹参中一种水溶性酚酸，具有改善血液流变学、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂等药理作用，属于冠心病治疗的关键药性成分，同时也是药典中复方丹参滴丸的含量测定成分。三七皂苷是三七的质量控制指标成分，药理学研究表明三七皂苷具有降低耗氧、扩张血管、抑制血小板聚集等作用。本文建立UHPLC 含量测定方法，同时测定丹参素钠、人参皂苷Rg，并在预试验中发现三七皂苷中人参皂苷 Rg1 在大鼠血浆和组织中含量较高，考虑到后期大鼠体内研究，最终选择人参皂苷Rg作为提取工艺评价指标之一。

中药材煎煮后的药液若不经醇沉、水沉等处理会含有多糖、淀粉、鞣质等杂质，不能进行注射或眼用，除杂过程也伴随着有效成分的损失。本课题组前期工作已证实药物经眼全身递送的可行性，且冰片因其易挥发的性质一般在药材提取完成后加入，因此本文以丹参素钠、人参皂苷Rg和总固体含量为评价指标，使用AHPCRITIC 法确定权重系数，参考复方丹参滴丸的制备工艺，正交设计优选出复方丹参方中丹参与三七的水提工艺，并考察水煎液在醇沉调碱和水沉调酸过程中pH 对评价指标的影响，为后期复方丹参方的眼用制剂研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate3000 戴安超高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；旋转蒸发仪、SHK-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州科泰实验设备有限公司）；HH-501 超热恒温水浴（金坛市晶玻实验仪器厂）；DHG-9640AB 电热鼓风干燥箱（常州普天仪器制造有限公司）；PHS-3C 型pH 计（上海三信仪表厂）。

1.2 试药

丹参（批号：DS21-01）、三七（批号：SQ21-01）（安徽华貅药业有限公司）；丹参素钠对照品（批号：PS000270，纯度≥98%）、人参皂苷Rg对照品（批号：DST180323-009，纯度≥98%）（成都德思特生物技术有限公司）；95%乙醇、氢氧化纳、盐酸、磷酸（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水，甲醇和乙腈均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 丹参素钠和人参皂苷Rg1 的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Accucore C（100 mm×4.6 mm，2.6 μm），流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脱，见表1，流速：0.3 mL·min，检测波长：280 nm（丹参素钠）、203 nm（人参皂苷Rg），柱温：30℃，进样量：1 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution

时间/min乙腈（A）/%0.2%磷酸水（B）/%0 1090 6 1090 8 2179 112575 183367 284060

2.1.2 溶液的制备 精密称取丹参素钠、人参皂苷Rg对照品各10 mg，分别置于5 mL 棕色量瓶中，加70%甲醇制备成质量浓度为2 mg·mL的储备液，备用。分别精密吸取丹参素钠、人参皂苷Rg储备液适量，加70%甲醇稀释成每1 mL 分别含1 mg 丹参素钠、1 mg 人参皂苷Rg的混合对照品溶液。

精密称取45 g 丹参、8.8 g 三七于砂锅中，加入10 倍量超纯水，浸泡45 min 后煎煮2.5 h，煎液经纱布趁热过滤，离心后取上清液浓缩至50 mL，加适量乙醇至含醇量为75%，静置一夜，过滤，回收乙醇，浓缩并定容至50 mL 量瓶中；精密吸取适量复方丹参提取液，加70%甲醇稀释20倍，3000 r·min涡旋3 min，15 000 r·min离心10 min，离心两次，取上清液，即得。

分别按上述供试品溶液的制备方法制备缺丹参、缺三七的阴性样品溶液。

2.1.3 线性关系的考察 分别取“2.1.2”项下混合对照品溶液0.125、0.25、0.5、1、2、3 mL 置于5 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，按“2.1.1”项下色谱条件测定并绘制标准曲线。结果丹参素钠、人参皂苷Rg的线性回归方程分别为

y

＝0.0297

x

＋0.0933、

y

＝0.012

x

－0.0231，

R

均为0.9999。表明丹参素钠和人参皂苷Rg在25 ～600 μg·mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.4 专属性考察 取“2.1.2”项下各溶液进样1 μL 进行测定，结果见图1，待测组分与相邻峰的分离度均大于1.5，且各峰之间并无干扰，该方法的专属性良好。

图1 供试品（a）、对照品（b）、阴性供试品（c）的UPLC 色谱图Fig 1 UHPLC chromatograms of sample（a），reference（b），negative（c）

2.1.5 精密度考察 精密吸取混合对照品溶液适量，连续测定6 次，记录峰面积。丹参素钠峰面积的

RSD

为1.1%，人参皂苷Rg峰面积的

RSD

为0.29%，表明仪器的精密度较好。2.1.6 重复性考察 取适量复方丹参供试品溶液，平行制备6 份，进样测定，结果丹参素钠和人参皂苷Rg含量的

RSD

分别为1.6%、1.9%，均小于2%，表明方法重复性良好。2.1.7 样品溶液稳定性考察 取同一批复方丹参供试品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24 h 进样，结果丹参素钠、人参皂苷Rg峰面积的

RSD

分别为0.50%、0.38%（

n

＝6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。2.1.8 加样回收率考察 精密吸取适量供试品溶液（丹参素钠、人参皂苷Rg含量分别为73.70 μg、57.85 μg）于5 mL 量瓶中，共6 份，每份精密加入适量混合对照品溶液（丹参素钠、人参皂苷Rg含量分别为78.13 μg、56.53 μg），70%甲醇定容至刻度，进样测定，测得丹参素钠、人参皂苷Rg的平均加样回收率分别为101.41%、98.67%，

RSD

分别为1.3%、0.53%，表明方法回收率良好。

2.2 总固体含量测定

精密吸取10 mL 提取液于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，冷却并称定重量，计算总固体含量。

2.3 单因素实验

本实验以丹参素钠、人参皂苷Rg的含量为考察指标，结合相关文献考察了粒径、加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数对复方丹参方水提工艺的影响。粒径考察中发现丹参、三七药材经打粉机粉碎后大多能通过七号筛，由于饮片整体硬度不一致，通过二、三号筛的基本为外表皮部或韧皮部，而木栓部能通过九号筛，这说明药材过筛后存在部位差异性，无法保持单一变量进行单因素实验。浸泡时间的结果发现浸泡45 min后药材的提取效果最好，故药材煎煮前统一浸泡45 min。而对加水量、提取时间、提取次数的考察发现随着因变量的增大，有效成分的含量也随之增大，单因素实验结果见图2。

图2 单因素实验结果Fig 2 Single factor experiment

2.4 正交实验设计

根据前期单因素实验结果确定了考察因素，并以丹参素钠、人参皂苷Rg及总固体含量为考察指标，用L（3）正交设计表进行实验。因素水平见表2。

表2 因素水平表
Tab 2 Factor and level

水平因素加水量/A提取次数/B提取时间/C 1 8 1 1.5 2 1022.0 3 1232.5

2.5 指标权重的确立

2.5.1 层次分析法（AHP）法AHP 是将决策者的经验判断予以量化的主观权重赋权法。本文以丹参素钠、人参皂苷Rg和总固体含量作为权重指标予以量化，依据丹参、三七君臣配伍原则，指标优先顺序为丹参素钠含量＞人参皂苷Rg含量＞总固体含量，采用1 ～9 标度法评判两两指标之间的重要性并构造成对比较矩阵A，见表3。按式（1）计算矩阵A 中每一行元素乘积的

n

次方根

β

，对

β

＝（

β

，

β

，…，

β

）归一化后得到特征向量W ＝（W，W，…，W），即（0.7306，0.1884，0.0810）。

表3 指标成对比较的判断优先矩阵
Tab 3 Priority judgment matrices for pairwise comparison of indicators

权重指标含量（mg·g－1）丹参素钠人参皂苷Rg1总固体丹参素钠含量157人参皂苷Rg1 含量 1/513总固体含量 1/7 1/31

根据式（2）计算出矩阵最大特征值

λ

为3.0649，（AW）表示向量AW 的第

i

个元素，最后通过公式C.I.＝（

λ

－

n

）/（

n

－1）和C.R.＝C.I./R.I.计算出一致性检验指标（C.R.）＝0.0624 ＜0.10，即构造的成对比较矩阵具有满意的一致性，权重系数分别为0.7306、0.1884、0.0810。2.5.2 CRITIC 法CRITIC 法是完全依据数据本身的客观属性而科学评价的的客观赋权法。首先对表4 中的原始数据进行无量纲化处理[指标成分值＝（实测值－最小值）/（最大值－最小值）]，经MATLAB 处理后得到相关系数矩阵B和各指标对比强度（

S

），再通过下列公式计算出冲突性（

R

）、信息量（

C

）与权重（

W

），结果见表5。

表4 正交实验设计及结果
Tab 4 Design and result of orthogonal experimental

No.A B CD（误差）含量（mg·g－1）综合评分丹参素钠 人参皂苷Rg1 总固体111111.93884.36390.1918 47.93 212223.44624.90680.2398 74.97 313334.55345.41710.2593 94.89 421232.37603.93250.2178 54.24 522313.99084.85160.2392 83.68 623124.06457.07600.2698 92.02 731323.00804.21000.2212 65.43 832133.41725.85700.2546 77.58 933213.79256.14180.2608 84.66

表5 CRITIC 法相关计算数据(mg·g)
Tab 5 CRITIC method related calculation data (mg·g)

－1考察指标丹参素钠Sj0.3204 Rj0.4423含量（mg·g）人参皂苷Rg1总固体0.32550.3228 0.47740.2513 Cj0.14170.15540.0811 Wj0.37470.41090.2144

（注：

r

表示评价指标

i

和

j

之间的相关系数）

由表5 可知，CRITIC 法计算出的丹参素钠、人参皂苷Rg和总固体含量的权重系数分别为0.3747、0.4109、0.2144。

2.5.3 AHP-CRITIC 法AHP-CRITIC 法是由AHP 法和 CRITIC 法混合加权得到的方法，计算公式为

W

＝（WAHP×WCRITIC）/∑（WAHP×WCRITIC），

i

为第

i

个因素；

j

为第

j

个样本。AHP-CRITIC 混合加权法计算出的丹参素钠、人参皂苷Rg和总固体含量综合权重系数分别为0.7428、0.2101、0.0471。2.5.4 综合评分比较通过上述3 种计算方法得到相应的3 组权重系数，综合评分后的结果见表6。综合评分＝[（丹参素钠含量/丹参素钠最大含量）×0.7428 ＋（人参皂苷Rg含量/人参皂苷Rg最大含量）×0.2101 ＋（总固体含量/总固体最大含量）×0.0471]×100。采用MATLAB 软件对3 种计算方法进行相关系数分析。AHP 法与AHP-CRITIC 法的相关系数为1.000，CRITIC 法与AHP-CRITIC 法的相关系数为0.9715，AHP 法与CRITIC 法的相关系数为0.9703，3 组均有显著相关性（

P

＜0.01），说明3 种计算方法具有一致性的评分结果。AHP 法与 CRITIC法权重系数的相关系数为0.4834，相关性不显著（

P

＝0.6788），说明两者反映的信息不具有叠加性。因此采用AHP-CRITIC 法计算综合评分。

表6 3 种赋权法的综合评分
Tab 6 Comprehensive scores of three empowerment methods

?试验号AHPCRITICAHP-CRITIC 1 48.4956.5447.93 2 75.5675.9174.97 3 95.2789.5394.89 4 55.1359.7054.24 5 84.1380.0283.68 6 92.1695.9892.02 7 66.1166.7865.43 8 78.0782.3677.58 9 85.0387.6084.66

2.6 正交实验

对AHP-CRITIC 法计算的综合评分进行分析，直观分析结果见表7，方差分析结果见表8。

表7 直观分析结果
Tab 7 Intuitive analysis

因素ABCD（误差）k172.59755.86772.51072.090 k276.64778.74371.29077.473 k375.89090.52381.33375.570 R 4.05034.65610.043 5.383

表8 方差分析结果
Tab 8 Results of variance analysis

方差来源 偏差平方和 自由度FF 临界值 显著性A 27.8212 0.7676.940＞0.05 1863.195251.3746.940＜0.05 C 180.2082 4.9696.940＞0.05 D（误差）72.532－－－B

由表7 可知各因素对实验结果影响的大小，即提取次数（B）＞提取时间（C）＞加水量（A），直观分析最佳工艺为ABC。方差分析结果显示提取次数对综合评分影响显著（

P

＜0.05），加水量和提取时间对其无显著性影响，综合直观分析、方差分析结果并考虑到后期实验安排，最终确定提取工艺为ABC，即10倍水煎煮2.5 h，共提取3 次。

2.7 验证优化工艺

按处方量称取适量丹参、三七，按照最佳工艺ABC进行实验验证，重复3 次，结果见表9。结果表示在最佳提取工艺下，丹参素钠、人参皂苷Rg和总固体平均含量分别为6.0995、3.9546、0.2648 mg·g，

RSD

分别为0.95%、0.33%、1.6%，即正交设计优选出的最佳工艺是可行的。

表9 工艺验证实验(mg·g)
Tab 9 Process verification test (mg·g)

实验次数丹参素钠人参皂苷Rg1总固体1 6.04503.94360.2630 2 6.09283.95130.2695 3 6.16083.96890.2619平均值6.09953.95460.2648 RSD/%0.950.331.6

2.8 丹参、三七醇沉调碱、水沉调酸的pH 条件优化

中药滴眼液应按照中药注射液的制备方法来制备，参考丹参注射液标准制备工艺中醇沉调碱至pH 为8 ～9，水沉调酸至pH 为2 ～3。本文研究调碱至pH ＝8.0、8.5、9.0，调酸至pH ＝2.0、2.5、3.0 时丹参素钠、人参皂苷Rg和总固体含量的变化，实验均在室温（25 ℃）下进行，重复3 次，结果见表10。

由表10 可知pH 为8.0 时，丹参素钠、人参皂苷Rg收率均＞100%，这可能是溶液中其他成分在此pH 下转化而来，pH 从8.5 到9.0 变化时，丹参素钠、人参皂苷Rg收率均略微升高，但总固体除去率有所降低，因此综合考虑水煎液醇沉调碱可至8.0 ～8.5。当pH 在2.0 ～3.0 变化时丹参素钠收率和总固体除去率先升高后降低，但人参皂苷Rg收率一直在升高，pH ＝3.0时收率为92.48%，综上考虑水煎液水沉调酸可至2.5 ～3.0。

表10 各种pH 下醇沉、水沉的结果(%)
Tab 10 Alcohol precipitation and water precipitation under various pH values (%)

pH丹参素钠收率人参皂苷Rg1 收率总固体除去率8.0107.93111.9022.41 8.5 91.97 96.3327.04 9.0 92.81 98.9325.28 2.0 96.88 68.40 8.06 2.5100.24 79.70 9.15 3.0 97.07 92.48 7.22

3 讨论

丹参-三七是常用的活血化瘀药对，两者功效相近，配伍后功效倍增，研究表明两者合煎后能产生新的化合物，这也意味着两者配伍并不是简单的两药加和。目前，复方丹参方相关剂型中只有滴丸剂是由丹参、三七加水合煎制成，其他剂型均由丹参经醇提、水提分步提取后与三七细粉或其醇提物混匀制成，本文考察丹参、三七合煎时的水提工艺旨在为后期开发复方丹参方相关剂型提供基础。

中药复方中多指标权重系数的确定十分重要，过去考虑到复方多具有“君臣佐使”的组方原则，大多会根据经验确定权重系数，多有主观性，却忽略了客观数据信息的影响。本文采用了AHP-CRITIC 法计算综合评分，可兼顾主客观因素，得到的结果也更合理，更科学。

前期对水提方法和单因素实验考察发现丹参素对提取温度和时间要求较高，本文优选出的最佳水提工艺也证明了这一点，这是因为丹参有效成分中含量最高的丹酚酸B 会在高温下慢慢降解产生丹参素。而在实际生产中，考虑到耗能和成本问题，应从药材源头开始把控，确定最佳提取pH 值、合理药材二煎或三煎时间等，优选出适合实际生产的最佳工艺。