基于网络药理学和分子对接技术的天麻-川芎药对治疗高血压作用机制研究

王 媚，乔安平，贾小刚，刘 琳，李 佳，张小飞，史亚军，段琳瑜

陕西中医药大学药学院 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，咸阳 712046

近年来，高血压也成为全球性患病率较高的疾病之一，该病长期不控制会造成诸多靶器官的损伤，进而产生一系列诸如心血管，肾脏等方面的并发症。我国的成年人患病率达到了46.4%。目前，相关研究表明，天麻配伍川芎常用于高血压疾病、中枢神经系统疾病的治疗[1,2,3]。天麻息风止痉、平抑肝阳，是治疗肝阳上亢之眩晕、头痛的要药。现代药理研究发现，天麻具有降低血压、抗心肌缺血、改善脑部供血等药理作用[4,5]。川芎活血化瘀，去除外风，现代药理研究发现，川芎具有降低血压、改善血管内皮功能、增加冠脉血流量等药理作用[6,7]。两药配伍，不仅平抑肝阳、活血化瘀，还能改善血管内皮、降低血压的同时，保护靶器官的损伤[8]。

中药因其本身的成分复杂，作用宽泛的特点及其与机体相互作用的复杂性，从分子水平系统对天麻-川芎药对治疗高血压的作用机制进行解释困难重重。然而基于药物-疾病-靶点相互作用基础上的网络药理学，能够揭示多分子药物协同作用的过程，这与中医药诊治疾病的原理殊途同归[9]。本研究借助网络药理学和分子对接的方法，探讨天麻-川芎药对治疗高血压的作用靶点和机制，为后续治疗高血压及其药物筛选(临床应用)提供更多的科学依据。

1 资料与方法

1.1 天麻和川芎活性成分筛选及靶点的获取

在数据库(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分别输入关键词天麻(TIAN MA)，川芎(CHUAN XIONG)进行检索，以口服生物利用度≥30%，药物相似性≥0.18为条件，获取整理得到天麻、川芎的活性成分和对应的潜在靶点。

1.2 高血压相关靶点的获取

在数据库Drugbank(https://www.drugbank.ca/)和CTD(http://ctdbase.org/)中输入关键词“hypertension”进行检索，整理获得疾病的靶点。

1.3 药对作用于高血压的靶点筛选

将分别通过TCMSP数据库、Drugbank和CTD数据库获取的天麻、川芎、高血压对应的靶点，利用Rx64 3.6.2软件绘制韦恩图，得到天麻-川芎药对干预高血压的共同潜在作用靶点。

1.4 药对-疾病-活性成分-靶点网络构建

将获得的共同潜在作用靶点在UniProt数据库中选择物种为“homo sapiens”，得到对应的官方名称，进而获取对应的活性成分，借助Cytoscape 3.2.1软件进行可视化处理，构建药对-疾病-活性成分-靶点的网络图。

1.5 蛋白相互作用PPI网络构建及核心靶点筛选

借助STRING数据库(https://string-db.org)研究蛋白与蛋白的相互作用，挖掘其关键靶点。将药对与疾病的共同靶点导入STRING数据库，设置物种为homo sapiens，设置交互分数为>0.4，去除单一蛋白，获得PPI网络图。

1.6 GO功能富集分析与KEGG富集分析

利用Metascape(http://metascape.org/)对核心靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。

1.7 分子对接

借助Discovery Studio 4.0软件实现分子对接。在天麻-川芎治理高血压的蛋白互作图中选取排名靠前的核心靶点，利用PDB数据库(https://www.rcsb.org/)找出与其对应的靶点蛋白结构，进一步在Drugbank上找到核心靶点对应的阳性药物并下载其化合物的2D结构，再将其与靶点蛋白3D结构和化合物导入Discovery Studio进行分子对接，获得核心靶点蛋白及其化合物以及与阳性药物的相互作用图。

2 结果

2.1 天麻和川芎活性成分筛选结果

天麻-川芎药对是治疗高血压的常用药对，将这两味中药在中药系统药理学分析平台TCMSP数据库进行搜索。其中天麻活性成分11个，川芎活性成分96个；再对其活性成分潜在的作用靶点进行筛选收集，利用基因转换文件将活性成分基因全称转化为基因简称，其中天麻11个活性成分，对应靶点138个；川芎96个活性成分，对应靶点2 087个；删除其重复项，共得天麻-川芎药对活性成分107个，作用靶点1 010个。

2.2 高血压相关靶点的筛选和韦恩图绘制

将高血压(hypertension)在Drugbank和CTD数据库搜索靶点，以Score值从大到小排列，选取Score≥73为条件进行筛选，获得与高血压相关的靶点2 268个。将天麻-川芎药对得到的1 010个靶点和高血压的2 268个靶点借助Rx64.3.6.2软件找出药对-疾病共同的靶点428个。韦恩图如图1。

2.3 药对活性成分-靶点-疾病网络构建

借助Cytoscape 3.2.1软件进行“药对活性成分-靶点-疾病”网络构建，运用network ananlyzer对所得的网络图进行分析，得到degree平均值为8.314，再按照大于平均值(8.314)小于最大值(428)进行筛选，得到活性成分-靶点-疾病图，即70个活性成分，83个相关靶点。说明天麻-川芎药对治疗高血压可能是通过这70个活性成分，83个靶点发挥作用的。节点标记3种不同颜色成分来分别表示2种药物的活性成分和靶点，蓝色节点代表靶点，紫色节点为川芎，绿色节点为天麻成分，红色代表疾病高血压，如图2所示。其所对应的活性成分如表1所示。

图1 药对靶点与疾病靶点的韦恩图Fig.1 Venn diagram of chemical component target of herb pair and hypertension target

图2 “药对活性成分-靶点-疾病”网络构建Fig.2 “Chemical component-target-disease core” network of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair

表1 天麻-川芎药对化合物名称对应表Table 1 Corresponding table of compound names of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair

2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选

将筛选后的83个靶点输入STRING数据库，对83个关键靶点进行PPI网络构建，如图3所示，将score大于0.70的通过Cytoscape 3.2.1进行可视化处理，进行靶点-靶点网络构建，根据度值(degree)将核心靶点排序得到图4。度值越大，颜色越深(红色)，圆点也越大，在内圈；度值越小，颜色越淡(黄色)，圆点就越小，在外圈。其中最主要的靶蛋白有degree=28的肿瘤坏死因子(TNF)；degree=26的前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、人内皮素1(EDN1)；degree=24的重组人白介素(IL1B)；人瘦素(LEP)；类胰岛素生长因子(IGF1)；degree=23的过氧化氢酶(CAT)、雌激素受体基因(ESR1)；degree=22的多巴胺受体(DRD2)、糖皮质激素受体基因(NR3C1)；degree=19的载脂蛋白(APOE)；degree=18的白细胞介素(IL10)；degree=17的膜连蛋白(ANXA1)；degree=16的催产素(OXT)、雄激素受体(AR)、c反应蛋白(CRP)、β连环蛋白(CTNNB1)。

图3 天麻-川芎药对治疗高血压的蛋白质相互作用(PPI)网络图Fig.3 PPI network of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair in treatment of hypertension

图4 核心靶点排序图Fig.4 Core target ranking chart

2.5 GO功能富集分析与KEGG富集分析

将83个核心靶点上传至Metascape，参数设置为H species，进行GO功能富集分析，共获得1 366条GO条目，其中生物进程主要涉及血液循环(blood circulation)、循环系统过程(circulatory system process)、细胞对有机环化合物的反应(cellular response to organic cyclic compound)、系统过程调节(regulation of system process)、化学性突触传递(chemical synaptic transmission)、顺行跨突触信号(anterograde trans-synaptic signaling)等方面。分子功能主要涉及核受体活性(nuclear receptor activity)、转录因子活性(transcription factor activity)等方面。细胞组分主要涉及突触膜(synaptic membrane)、突触后膜(post synaptic membrane)、突触后(post synapse)等方面(如图5)。

图5 GO分析结果Fig.5 GO analysis results注：BP：生物进程；CC：细胞组分；MF：分子功能。Note:BP:Biological process;CC:Cell component;MF:Molecular function.

对83个核心靶点进行KEGG通路富集分析后，依据P值≤0.5排序筛选出前20条通路(如图6)。圆点大小代表富集到此通路的基因数目，颜色代表lg P value值，从蓝色到红色，表示lg P value从大到小，富集程度越来越显著。结合文献，钙信号通路(calcium signaling pathway)可能是天麻-川芎药对治疗高血压的最重要通路[22](如图7)。神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、癌症的途径(pathways in cancer)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)等可能是较重要的信号通路。

2.6 分子对接分析

利用Discovery Studio 4.5软件选取天麻-川芎药对治疗高血压的蛋白互作核心靶点排序中度值最高的前三个靶点TNF、PTGS2、EDN1以及与其相对应的化合物进行分子对接，同时以相应靶蛋白的阳性药进行对照验证(见表2)。其中间羟基苯甲酸、油酸、亚油酸乙酯、反式β-金合欢烯、十四烷与靶点TNF、PTGS2、EDN1有着良好的结合力(见图8)。对接结果说明天麻川芎药对治疗高血压是通过多靶点，多成分进行干预的。

3 讨论与结论

目前高血压是我国发病率较高的疾病之一，慢性的长期高血压会引起一系列的并发症。在中医上将其归为“眩晕”“头痛”范畴。文献显示，天麻、川芎配伍，天麻息风止痉，主头风、头痛，是治疗高血压的前十位中药之一[10]，川芎活血化瘀、祛风止痛。两者配伍相辅相成，是治疗中枢神经系统方面的经典药对[11]，也在治疗高血压的方剂中作为重要药对经常配伍出现[10,12,13]。

本研究分析得到了天麻-川芎药对治疗高血压的潜在作用靶点83个，涉及活性成分71个，其中天麻素、谷甾醇、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲醇等活性成分是天麻治疗高血压的有效成分；阿魏酸、川芎哚、洋川芎醌、洋川芎内酯、谷甾醇等活性成分是川芎治疗高血压的有效成分，运用用药规律分析也挖掘到天麻-川芎参与治疗高血压的主要药物[14-16]；有研究表明，天麻-川芎药对在药效学上，天麻能够提高川芎中阿魏酸等有效成分的吸收并延长其作用时间，川芎中洋川芎内酯可增加天麻有效成分的入脑量，延长半衰期，进而提高生物利用度[17]。

图6 天麻-川芎治疗高血压潜在靶点KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair in treatment of hypertension

图7 天麻-川芎药对治疗高血压的重要通路-钙信号通路Fig.7 An important pathway of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair in treatment of hypertension disease-calcium signaling pathway

表2 核心靶点与对应化合物结合活性得分Table 2 Score of binding activity between core targets and corresponding compounds

续表2(Continued Tab.2)

图8 核心靶点与核心成分、阳性药物分子对接图Fig.8 Molecular docking results of core targets combined with core components and positive drugs注：A：肿瘤坏死因子和间羟基苯甲酸；B：肿瘤坏死因子和7,8-二甲基-10-(1′-D-核糖基)-异咯嗪；C：前列腺素G/H合成酶2和间羟基苯甲酸；D：前列腺素G/H合成酶2和二十碳五烯酸的乙酯；E：人内皮素1和反式β-金合欢烯；F：人内皮素1和TBC-3711。Note:A:TNF and m-hydroxybenzoic acid;B:TNF and riboflavin;C:PTGS2 and m-hydroxybenzoic acid;D:PTGS2 and icosapent;E:EDN1 and trans-β-farnesene;F:EDN1-TBC-3711.

在PPI分析中靠前的靶点有肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、人内皮素1(EDN1)、重组人白介素(IL1B)、人瘦素(LEP)、类胰岛素生长因子(IGF1)、雌激素受体基因(ESR1)、多巴胺受体(DRD2)、糖皮质激素受体基因(NR3C1)、过氧化物酶体增殖物受体基因(PPARG)、载脂蛋白(APOE)等。其中PTGS2主要引起炎症反应[18]；END1是血管收缩调节的内源性重要因子，在维持血管张力和心血管稳态中发挥重要作用[19,20]。此外，雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)α、β在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等重要血管组织中均有表达。AR作为雄激素的中介物质，其通过与雄激素结合而发挥作用。雌激素受体基因(ESR1)编码了ERα，ERα在舒张血管、促进新血管形成和心肌细胞凋亡中起着比ERβ更重要的心脏保护作用[21]。PPARG主要表达在脂肪组织，与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化、机体免疫有密切关系[2]。故推测天麻-川芎可以在炎症反应、胰岛素抵抗、调控血脂等方面产生作用以调节血压水平。

在GO和KEGG分析中，筛选出天麻-川芎20条信号通路与高血压相关，钙信号通路可能与其密切相关[22]。既往研究表明，血管内皮损伤导致炎症介质的释放参与了高血压的病理过程，促进并加重了高血压的发展[22]。有研究表明，TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应以及免疫系统异常是造成高血压发生的病理机制之一[23]，TNF-α即肿瘤坏死因子能够与受体结合后激活TNF通路产生促炎复合物，可见，TNF-α能够通过多种信号通路促使平滑肌细胞增殖，进而导致细胞内钙浓度增大，引发血管收缩，血压升高[24]。钙信号通路通过钙离子传感器STIM1调节钙离子的稳态，从而调节血管细胞稳定性，并通过发挥调脂、抗炎、改善内皮功能等多种效应，进而对高血压发生发展过程中的多因素多环节起到调节作用，起到延缓病理进展的作用[25]。这与文献报道的天麻-川芎药对通过降低TNF等炎症因子水平抑制NF-κB通路，调节血管内皮细胞，调节细胞内钙、钠的稳态，抑制炎症反应而实现降压是一致的[26,27]。现代药理研究表明平肝潜阳类药物可通过改善血管内皮功能、调节RAAS系统、调节中枢交感神经等方式起到降压的作用[20]。进一步从分子对接的角度说明蛋白与配体的结合活性，结合文献，选取了排名靠前的三个关键靶点TNF、PTGS2、END1，再结合与蛋白有关的3个阳性药，配体选择与其对应的成分化合物，结果表明，天麻-川芎药对对于高血压的干预效果中，其蛋白配体的结合活性优于与阳性药的结合；天麻中的天麻素、间羟基苯甲酸与靶点作用力强，川芎中的阿魏酸、洋川芎内酯与靶点作用力强，表明两者协同起作用，与文献一致[17]。其对应的靶点也显著富集在钙信号通路、TNF信号通路等多条信号通路上，充分证明了该药对是多途径协同作用的。

综上，本研究通过借助网络药理学和分子对接的方法，对天麻-川芎药对治疗高血压的作用机制进行了初步的探讨，揭示了天麻-川芎药对可能通过谷甾醇、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲醇、天麻素、阿魏酸、川芎哚、洋川芎醌等潜在有效成分，共同作用于TNF、PTGS2、EDN1等多个靶点；通过钙信号通路、癌症的途径和TNF信号通路等，参与细胞内钙钠离子转运，血管内皮功能、炎症反应、糖脂代谢和氧化应激等发挥降压的作用，证明了该药对通过多成分、多途径和多靶点协同作用治疗高血压的，为进一步研究天麻-川芎药对治疗高血压的分子生物学验证奠定了理论基础。