慢性阻塞性肺疾病合并肺癌患者血清miR-210相对表达水平与肺功能和Th17相关细胞因子的相关性分析*

王国茗 ,尹照萍 ,潘巍巍 ,刘国峰 ,符一宁

辽油宝石花医院:1.呼吸及危重症医学科;2.肿瘤科,辽宁盘锦 124010

慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺癌为全球性高发病率、高病死率的疾病,均为重大公共健康问题[1]。流行病学研究证实,吸烟致COPD 患者合并肺癌的概率远远大于非吸烟COPD 患者,COPD 是诱发肺癌的危险因素,且肺癌是导致COPD 患者最常见的死亡原因[2]。COPD 合并肺癌的发病率呈逐年增加趋势,临床工作中,COPD 合并肺癌的诊治情况仍不乐观,早期诊断、判断病情进展对提高疗效、改善患者预后至关重要。

微小RNA(miR)-210作为重要的缺氧敏感型微小RNA 分子,在实体肿瘤缺氧微环境中变化显著,促使细胞发生凋亡逃逸,导致细胞增殖失控并发生癌变倾向[3]。研究证实,COPD 对肺癌免疫微环境产生影响,且在免疫治疗中COPD 合并肺癌患者能够获益,提示COPD 异常炎症免疫状态在肺癌诱发、恶性进展过程中发挥作用[4]。辅助性T 细胞17(Th17)是体内重要的免疫细胞,在调节炎症免疫方面发挥重要作用,尤其在慢性炎症继发肿瘤过程中更为明显[5]。

鉴于此,本研究拟探讨血清miR-210表达水平与患者肺功能、Th17 相关细胞因子的关系及其诊断COPD 合并肺癌的价值,旨在为该病的诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1月至2020年12月本院收治的COPD 合并肺癌患者(COPD 合并肺癌组,n=60)、单纯肺癌患者(肺癌组,n=60),单纯COPD患者(COPD 组,n=80),以及同期体检健康者(健康对照组,n=100)为研究对象,COPD 符合《慢性阻塞性肺疾病基层诊疗指南(2018年)》中的诊断标准[6],肺癌符合文献[7]中的诊断标准,排除未完成肺功能检测、合并其他恶性肿瘤、合并自身免疫性疾病、合并支气管哮喘、肺结核等肺部疾病患者。

COPD 合并肺癌组患者中男43例,女17例;年龄52～81岁,平均(67.52±10.41)岁;36例患者有吸烟史,24 例患者无吸烟史;吸烟指数(1 036.2±323.5);病理类型:鳞癌31 例,腺癌18 例,其他11例。肺癌组中男45例,女15例;年龄50～80岁,平均(65.24±9.46)岁;38例患者有吸烟史,22例患者无吸烟史;吸烟指数(937.9±315.3);病理类型:鳞癌29例,腺癌19例,其他12例。COPD 组中男57例,女23例;年龄51～81岁,平均(66.43±9.02)岁;45例患者有吸烟史,35 例患者无吸烟史;吸烟指数(995.3±306.3)。健康对照组中男71 例,女29 例;年龄53～79岁,平均(65.62±9.23)岁。4组研究对象性别构成、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究患者及其家属签署知情同意书,且本研究经本院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 血清标本收集 以普通采血试管于清晨采集所有研究对象静脉血4～5 mL,以2 000 r/min 在-5 ℃环境下离心10 min,收集上层血清2 mL,分装于两个试管,每个试管1 mL。其中一个即刻送实验室进行miR-210检测。另一个则置于-80 ℃冰箱保存备用,保存期为6个月。使用前,从-80 ℃冰箱转移至-5 ℃冰箱放置30 min,再放置室温下至缓慢融解,即刻送实验室进行miR-210检测。

1.2.2 miR-210 检测 采用RNA 提取试剂盒(51028-M,常州百代生物科技股份有限公司)提取血清RNA;采用逆转录试剂盒(K1652,美国Thermo Fisher公司)、PCR 仪(ABI9700,美国ABI公司)合成cDNA;采用荧光定量PCR 仪(Rotor-Gene 3000,德国Qiangen公司)进行定量检测,定量引物(上海生工生物工程公司设计和合成)序列如下,miR-210-F:5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3';miR-210-R:5'-TAT CTG TGC GTG TGA CAG CGG CT-3'。U6-F:5'-CTC GCT TCG GCA GCA C-3';U6-R:5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC G-3'。反应条件如下:95 ℃预变性10 min,40 个循环;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s。以U6为miR-210内参,采用2-ΔΔCt计算miR-210相对表达量。

1.2.3 肺功能检测 采用肺功能检测仪(Master Screen PFT System,德国耶格公司)检测受试者的用力肺活量(FVC)、第1 秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1预计值百分比(FEV1%pred)及呼气流量峰值(PEF)等肺功能指标。

1.2.4 Th17相关细胞因子检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血Th17相关细胞因子指标水平。具体步骤如下:收集受试者晨起空腹外周血10 mL,低温2 000 r/min 离心10 min,收集上清液,ELISA 试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)检测白细胞介素(IL)-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0软件对数据进行分析。计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两对比采用LSD-t检验。计数资料以百分数表示,组间比较采用χ2检验。相关性采用Pearson 相关分析。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miR-210诊断COPD 合并肺癌的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-210、肺功能及Th17相关细胞因子比较 各组血清miR-210相对表达水平、肺功能指标及Th17相关细胞因子指标水平差异均有统计学意义(P<0.05)。健康对照组、COPD 组、肺癌组、COPD 合并肺癌组患者血清miR-210相对表达水平逐渐升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。健康对照组、COPD 组、肺癌组、COPD 合并肺癌组患者肺功能指标水平逐渐降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。健康对照组、COPD组、肺癌组、COPD 合并肺癌组患者Th17相关细胞因子指标水平逐渐升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清miR-210相对表达水平、肺功能指标及Th17相关细胞因子水平比较()

表1 各组血清miR-210相对表达水平、肺功能指标及Th17相关细胞因子水平比较()

注:与健康对照组比较,*P<0.05;与COPD组比较,#P<0.05;与肺癌组比较,▽P<0.05。

2.2 COPD 合并肺癌组患者血清miR-210相对表达水平与肺功能指标、Th17相关细胞因子指标的相关性 Pearson相关分析显示,COPD 合并肺癌组患者血清miR-210相对表达水平与FEV1/FVC、FEV1%pred、PEF 呈负相关(P<0.05),与IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 COPD 合并肺癌组患者血清miR-210相对表达水平与肺功能指标、Th17相关细胞因子指标的相关性(n=60)

2.3 血清miR-210相对表达水平对COPD 合并肺癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,血清miR-210相对表达水平诊断COPD 合并肺癌的曲线下面积(AUC)为0.704(95%CI:0.525～0.944);血清miR-210相对表达水平的截断值为2.8时,具有较高的灵敏度(66.67%)和特异度(75.00%),约登指数为0.417。

续表2 COPD 合并肺癌组患者血清miR-210相对表达水平与肺功能指标、Th17相关细胞因子指标的相关性(n=60)

3 讨论

吸烟、烟雾暴露、慢性炎症及遗传易感性等均为COPD合并肺癌的易感因素,具体发病机制尚无统一结论。近年来有学者提出,肺癌可能是COPD的最终结局[8]。COPD 合并肺癌多发于60岁以上男性长期吸烟人群,且COPD 呼吸道症状可能掩盖肺癌患者早期临床症状,导致患者漏诊、误诊,COPD 合并肺癌确诊时多为晚期,受自身肺功能限制的原因,无法接受根治性治疗,治疗难度大,预后差[9]。高危人群定期检查肺功能、检测血清诊断标志物,有助于早期诊断,提高治疗效果,改善生活质量和提高预后。

COPD 是一种慢性炎症性肺部疾病,肺组织反复的损伤、修复引发瘢痕,导致肿瘤发生[10],可见异常炎性反应在COPD 疾病进展、恶化为肺癌的过程中发挥重要作用。miR-210 已被证实在急性脑梗死、肝炎、脓毒症等疾病的炎症病理过程中发挥作用,且与IL-6、TNF-α 等炎症因子间存在相关性[11];缺氧是COPD、COPD 合并肺癌患者的重要特征,而对缺氧敏感的miR-210可能在COPD 在发生、发展过程中发挥调节功能[12]。

本研究发现健康体检者、单纯COPD 患者、单纯肺癌患者、COPD 合并肺癌患者血清miR-210相对表达水平逐渐升高,初步证明miR-210 高表达可能与COPD 异常炎症、肺部癌变有关;研究证实VEGF 与肺癌血管生成关系紧密[13],miR-210作为实体瘤在缺氧条件下变化最显著的miRNA 分子,笔者推测,miR-210可能通过调节VEGF 表达促进肿瘤血管新生、协助肿瘤细胞免疫逃逸,诱发肺癌[14]。

肺功能检查是诊断COPD的“金标准”。本研究发现,与健康体检者比较,单纯COPD 患者、单纯肺癌患者的肺功能下降,且COPD 合并肺癌患者肺功能损伤较单纯COPD 患者、单纯肺癌患者更加严重,笔者推测COPD 患者肺功能下降,黏膜清除能力下降,可能是导致肺部肿瘤形成的机制之一;此外,COPD 合并肺癌患者血清miR-210 相对表达水平与FEV1/FVC、FEV1%pred、PEF 呈负相关,表明监测血清miR-210相对表达水平,可在一定程度上评估患者肺功能损伤情况。

Th17细胞主要分泌IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α等促炎因子。研究表明,肺癌患者外周血Th17细胞水平升高[15];临床研究发现,Th17相关细胞因子水平升高可增加COPD 患者罹患肺癌发生的风险[16-17];Th17细胞促进炎性反应,在COPD 合并肺癌疾病发生、发展中发挥关键调控作用[15]。本研究发现,健康体检者、COPD 患者、COPD 合并肺癌患者的外周血IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α水平逐渐增加,且COPD合并肺癌患者血清miR-210水平与Th17相关细胞因子水平呈正相关,以上结果表明miR-210可在一定程度上预测患者炎症程度。

ROC曲线分析结果发现,血清miR-210 相对表达水平对诊断COPD 合并肺癌有一定价值(AUC 为0.704),但存在灵敏度偏低的局限。此外,COPD 合并肺癌确诊患者多为晚期,本研究纳入COPD 合并肺癌的病例较少,后续将收集更多的样本从而进一步探讨miR-210作为诊断COPD 合并肺癌标志物的可能。

综上所述,COPD 合并肺癌患者血清miR-210相对表达水平增加,且与患者肺功能及Th17相关细胞因子指标水平有关,可一定程度上反映患者病情严重程度,血清miR-210可作为辅助诊断COPD 合并肺癌的分子标志物。