定向富集中药材中岩大戟内酯A的分子印迹膜的制备

＊肖月 肖兰 黄远 吴蓉 覃江陶 王海君

（齐齐哈尔医学院药学院 黑龙江 161006）

狼毒大戟中分离得到的岩大戟内酯A（JA）具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等活性，在医药领域受到广泛关注[1-2]。但此类活性成分含量较低、分离纯化困难。天然药物的常规分离方法如制备型高效液相色谱法、硅胶柱色谱法等存在溶剂消耗量大、效率低、微量有效成分易丢失等缺点。近年来，在模板分子周围建立三维聚合物基体，去除模板后可以留下形状和官能团互补的印迹腔，从而制备出可以定向识别和吸附目标分子的分子印迹技术引起了人们的关注[3-4]。该项技术具有分子识别性强、操作简单、性质稳定、溶剂消耗量小、模板和印迹聚合物可回收再利用等诸多优点，在中药有效成分如黄酮、生物碱、多元酚类的提取分离中已有应用[5-6]。其中，具有较大表面积的分子印迹聚合物膜（MIF）可以通过吸附、渗透选择性地将目标分子从混合溶液中运输出来，在提高分离效率方面更具优势[7-8]。此技术已在食品、医药、环境等领域得到了应用，然而，在天然药物活性成分的提取和分离方面应用的研究较少。

本文采用狼毒大戟中提取的JA为模板分子，甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，通过自由基热聚合法成功制备了具有选择性富集、快速分离JA的MIF。对膜的形貌和结构进行了表征，并对膜特异吸附性能进行了研究。应用在中药材狼毒大戟中JA的定向富集与分离，为JA的提取分离探索了新的研究思路。

1.实验部分

(1)主要仪器与试剂

KQ-600V超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）、RE-5ZC旋转蒸发器（巩义予华仪器有限责任公司）；DT系列电子天平（常熟意欧仪器仪表有限公司）；Bruker Advance 400型超导脉冲傅立叶变换核磁共振仪测定（德国布鲁克公司）；Bruker Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪、S-4300扫描电子显微镜（日本日立公司）；Waters-2535型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；5427R型离心机（德国艾本德公司）。

狼毒大戟（齐齐哈尔医学院药用植物园）；乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮异丁腈、3-（甲基丙烯酰）丙基三甲氧基硅烷、甲基丙烯酸（分析纯，萨恩化学技术有限公司）；乙酸、乙腈、石油醚、无水甲醇、无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）。

(2)岩大戟内酯A的提纯与UPLC法的确立

按参考文献[9]的工艺提取、分离、纯化得到JA，1HNMR、13C-NMR数据与文献报道结果一致，纯度大于98%，符合制备MIF模板分子的要求。按参考文献[10]的色谱条件确立超髙效液相色谱法（UPLC）检测JA，该色谱条件下JA的保留时间为5.58min。在2～55.00μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，峰面积随浓度的变化标准曲线为Y=2486.5X+708.43（R2=0.9995）。

(3)分子印迹膜的制备与表征

0.1mmol JA和0.5mmol MAA超声溶解在10mL氯仿中，置于4℃冰箱中6h后取出，分别加入2mmol EDMA和0.1mmol AIBN，超声混合10min。充氮排氧15min后于60℃水浴摇床中预聚12h。取出冷却后将预聚液涂于两玻璃片之间，排氧后于60℃真空干燥箱中聚合6h。取出冷却后用去离子水、甲醇清洗膜表面。甲醇/乙酸（9:1，v/v）索氏抽提至洗脱液中无JA，干燥10h后得MIF。非印迹膜（NIF）的制备时除预聚时不加模板分子JA，其余反应条件均与MIF制备过程相同。

红外光谱表征其结构（KBr压片，2cm-1分辨率下32次连续扫描，波长范围4000-500cm-1）。扫描电镜表征其表面形貌。

(4)特异吸附实验

狼毒大戟中提取的其他三种化合物，羽扇豆醇（LA）、没食子酸（GA）、狼毒乙素（ECB），做MIF的特异识别性能考察。分别配置配制50μg·mL-1的JA、LA、GA、ECB溶液。室温将直径为2cm的MIF、NIF分别置于其中2h，取出后检测吸附量，计算印迹因子（α=Qe,MIF/Qe,NIF）。

(5)JA的富集

将直径为2cm的MIF置于10mL的狼毒大戟提取物石油醚萃取液中吸附30min，洗脱60min后浓缩洗脱液，检测JA的含量。

2.结果与讨论

(1)分子印迹膜的形貌与结构

图1为MIF表面形貌的电子显微镜图片，薄膜表面光滑、无裂痕，呈疏松、多孔结构。图2为MIF和NIF的红外光谱谱图，2970cm-1为膜结构中-C-H不对称伸缩振动峰，1730cm-1为C=O特征峰，1240cm-1和1160cm-1为O=C-O和C-O-C的不对称伸缩振动特征峰。谱图中NIF和MIF具有几乎相同的特征吸收峰，由此也可判定JA己被完全除去。

图1 分子印迹膜的SEM照片Fig.1 SEM images of MIF

图2 红外光谱Fig.2 Infrared Spectrum

(2)功能单体的筛选

图3为MAA、AM、VP作为功能单体制备的MIF对JA的吸附量和印迹因子对比图。对JA的印迹因子（α=Qe,MIP/Qe,NIP）分别为4.5、3.3、3.2，吸附量依次下降，因此，MAA是最适合的单体。

图3 不同功能单体制备的MIF对JA吸附量和印迹因子Fig.3 The adsorption capacity and imprinting factor of MIF towards JA prepared by different functional monomers

(3)特异吸附性能

图4分别为MIF、NIF对JA及其他三种狼毒大戟提取物的选择性吸附对比图。MIF对JA的识别能力明显高于其他结构，而NIF对几种化合物的吸附无明显差距。LA的结构比JA多一个环，分子形状虽然类似但体积较大，与MIF的印迹腔结构和位点并不匹配，因此没有表现出特异性的吸附。GA、ECB两个分子的体积较小，结构与MIF印迹空腔不匹配，只是产生少量的非特异性吸附。经计算四种化合物印迹因子分别为4.5，0.51，1.20，0.90，其中JA的印迹因子明显优于其它化合物，证明MIF对JA具有良好的选择性特异吸附性能。

图4 MIF对JA的选择性吸附Fig.4 Selectivity of MIF towards JA

(4)实际应用于中药材中JA的富集

取中药材狼毒大戟提取物石油醚萃取液作为样品溶液，将MIF浸渍于10mL样品溶液中进行吸附，然后取出洗脱。图5a、5b、5c分别为样品溶液、MIF浸渍30min后溶液、富集JA后的MIF洗脱液的色谱图。结果表明，MIF对狼毒大戟提取物中的JA具有良好的选择性富集作用，MIF富集JA后洗脱液中JA的纯度为83%。

图5 MIF对中药材萃取液中JA的富集液超高效液相色谱Fig.5 UPLC chromatograms of sample solution (a),solution adsorbed by MIF for 30 min (b) and eluent of MIF (c)

3.结论

选择性吸附岩大戟内酯A的分子印迹膜可以将岩大戟内酯A从中药材中定向地富集、分离，不仅克服了传统色谱法操作复杂、溶剂量大的缺点，而且避免了传统分子印迹法离心、过滤和后处理的麻烦。将膜在中药材提取液中浸渍后洗脱就可以很容易地获得岩大戟内酯A，使岩大戟内酯A的分离效率显著提高。