ICU病房耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的同源性分析

戚少云，黄 杰，王 璐，黄新明

鲍曼不动杆菌是一种临床上常见的引起严重甚至致死性感染的病原菌。随着抗菌药物在临床上的广泛应用，多重耐药鲍曼不动杆菌的医院感染越来越严重。碳青霉烯类抗菌药物是治疗鲍曼不动杆菌的主要药物[1]，但是随着该类抗菌药物在临床上的大量应用，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)的产生不可避免。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是通过分析细菌蛋白质表达谱中的特征谱峰来对细菌进行鉴定及分型，与脉冲场凝胶电泳结果之间具有很好的相关性[2-3]。其优点是灵敏度高、通量高、能耐受一定的杂质等[4]，随着质谱数据库及操作规程不断完善和规范化，MALDI-TOF MS将成为临床微生物鉴定的重要工具，可以及时将疑似的医院感染暴发预警信息反馈至临床科室及相关部门[5]，指导感控措施的有效改进。本研究对CRAB耐药性进行研究，同时用MALDI-TOF MS对分离的CRAB进行同源性分析。现作报道。

1 材料与方法

1.1 菌株 收集我院ICU病房2017年4-10月住院病人送检标本中分离得到的CRAB，共30株。30株菌株分离自28例病人送检标本中，其中男22例，女6例；≥60岁25例，<60岁3例，年龄(68.86±13.32)岁；标本来源：痰液26株，血液3株，胆汁1株。所有菌株均为连续分离的非重复菌株，同一病人同一部位只取第一次分离株。质控菌株为鲍曼不动杆菌ATCC 19606，大肠埃希菌ATCC 8739，系安徽医科大学第一附属医院检验科惠赠。

1.2 主要仪器 VITEK-2 COMPACT全自动微生物鉴定药敏分析仪、VITEK MS质谱仪(法国生物梅里埃公司)。

1.3 药敏试验 采用琼脂稀释法测定常用抗菌药物对菌株的最低抑菌浓度(MIC)。试验操作及折点判断依据2017年美国CLSI标准，分析药敏试验结果。所用抗菌药物包括头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、左氧氟沙星等。

1.4 同源性分析 用1 μL一次性定量接种环挑取生长24 h的新鲜单个纯菌落，均匀涂抹在靶板上，待菌膜干燥时加1 μL α-腈基-4-羟基肉桂酸基质液，干燥后使用VITEK MS科研库进行鉴定及聚类分析。每个菌株靶板在不同位置被激光点击160次，获得其蛋白质峰图。将细菌相对分子质量2 000～20 000的蛋白质峰图与数据库里参考图谱比较并进行多种算法计算，给出鉴定结果。可信水平在60.0%～99.9%的为可接受结果。通过对细菌核糖体蛋白峰谱图进行数学统计，在MALDI Biotyper 3软件中绘制发育树进行聚类分析，分析菌株之间的同源性。

2 结果

2.1 药敏试验结果 30株CRAB对头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星耐药率为100.0%，对左氧氟沙星耐药率为73.3%(见表1)。

表1 30株CRAB的药敏试验结果[n；百分率(%)]

2.2 MALDI-TOF MS同源性分析结果 依据相似度80%～100%为同一型别的分类方法，将30株CRAB分为三大簇：Ⅰ型(28株)、Ⅱ型(1株)、Ⅲ型(1株)，其中Ⅰ型分为Ⅰa型(26株)、Ⅰb型(1株)、Ⅰc型(1株)(见图1)。

2.3 流行情况 我院 ICU 病房共设床位30张，分设于同一楼层的东、西两个区域。其中西区21张、东区9张。2017年4-10月，我院 ICU 病房分离的CRAB主要流行株为Ia型(26株)，其中西区分离出19株，东区分离出7株。有2例病人的痰液和血液标本均检出Ⅰ a型菌株。2017年8月2-30日分离的Ⅰa型高达12株，提示当月ICU病房存在Ⅰa 型CRAB感染的聚集趋向。菌株分布详细信息见表2。

表2 30株CRAB菌株的基本信息

3 讨论

鲍曼不动杆菌是一种常见的条件致病菌，广泛存在于自然界、医院环境中，常在人体的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中定植[6]。在病人免疫功能下降、使用广谱抗生素和保留侵入性操作时显示其致病性，感染的高危科室和常见部位通常以ICU病房及下呼吸道为主。近年来国内监测数据表明，鲍曼不动杆菌的检出率已超越铜绿假单胞菌，在医院感染致病菌中排名前三位[7]。鲍曼不动杆菌可对多种抗菌药物产生耐药基因且感染后病死率达7.8%～75.0%[8-9]，病人一旦感染鲍曼不动杆菌，不仅会延长住院时间，增加住院费用，严重可危及生命安全。碳青霉烯类药物是治疗鲍曼不动杆菌的常用抗生素，然而由于临床抗生素的滥用，导致CRAB数量逐年增高。根据调查显示，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药率全国平均水平为56.1%[10]，耐药形势十分严峻。因此，及时对感染病人分离的菌株进行同源性分析，对控制鲍曼不动杆菌的院内传播有很大的帮助。

本研究分离的鲍曼不动杆菌对头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟等头孢菌素类抗菌药物以及喹诺酮类药物如环丙沙星的耐药率最为明显，达到100%，提示这些药物在临床使用中应加以限制。对氨基糖苷类抗菌药物如妥布霉素和庆大霉素以及一些其他种类的抗生素耐药率均在70%以上，治疗效果也很有限。

本研究使用MALD-TOF MS将2017年4-10月ICU 病人分离出的30株CRAB鉴定为3个型别，Ⅱ型和Ⅲ型各1株，其余28株均为Ⅰ型，其中Ia型高达26株。追踪临床资料发现首次分离出Ⅰ a型菌株为2017年4月3号，该病人因肺部感染、呼吸衰竭于2017年3月28日入院，病人痰培养中检出Ⅰa 型CRAB。在首次分离后，又陆续检出同样型别的菌株。感染病人多为免疫功能低下的高龄病人(60岁以上病人占比89.3%)，并且所有的病人均存在气管插管、泌尿道插管等侵袭性操作。菌株分离的病人床位多集中于该院ICU病房的西区(占比70%)，分析可能原因为东区病房属后期增设，相比西区，床位数少，床间距大，发生交叉感染的风险相对较低。

CRAB的临床治疗预后不良，迫切需要有效的措施以减少细菌在病人之间的传播。物体表面污染与CRAB流行和暴发有较强的关联性[11]，今后将加强对隔帘、床栏、床旁桌、呼吸机面板、监护仪面板、输液泵等高频接触的病人周围环境的清洁消毒[12]，借助荧光标记或ATP等工具审核清洁卫生质量，以保障清洁消毒措施的有效落实。医务人员的手也可能成为CRAB的传播媒介[13]，应加强对手卫生行为监管力度，提高依从率，有效切断病原菌的院内传播途径。今后还应增加感染病人的周围环境采样监测范围和频次，一旦检出CRAB，及时与病人感染部位检出的CRAB进行同源性检测分析，进一步完善全院CRAB流行病学资料，阐明CRAB传播扩散的具体途径，为临床改进CRAB防控措施提供更多的参考依据。