血清HBV大、中、小表面蛋白检测的临床意义

庄 辉

北京大学 医学部，北京 100191

1 HBV大表面蛋白(large HBV surface protein，LHBs)、中表面蛋白(middle HBV surface protein，MHBs)、小表面蛋白(small HBV surface protein，SHBs)的基因结构和特点

在自然条件下，HBV在冷冻电镜下为直径约52 nm的球状颗粒[1-2]，其外膜由3种外膜蛋白和不同脂类组成，包裹20面体核衣壳核心，该核心由240个核心蛋白亚单位组成，直径约36 nm；病毒体偶尔也可含直径为32 nm核衣壳核心，由180个核心亚单位组成。除病毒体外，被感染的肝细胞也分泌HBV表面蛋白的球状颗粒(直径为20 nm)和丝状颗粒(图1)。在高病毒血症患者的血清中，表面蛋白颗粒数量一般较病毒体多1000～10 000倍。由于这些颗粒不含病毒DNA，因此无传染性，只形成抗原血症[3]。

图1 HBV体和亚病毒颗粒(引自参考文献[3])

3种HBV表面蛋白均在一个开放读码框(open reading frame)内，由框内启动子编码，由2个不同的mRNA翻译：一个2.4 kb mRNA翻译LHBs，另一个2.1 kb mRNA翻译MHBs和SHBs，并各自由特异的启动子区转录，通过对蛋白表达的不同调节，合成大、中、小 3种表面蛋白。LHBs mRNA的preS1启动子含有肝脏特异性转录因子(即肝细胞核因子1)的结合位点[4]，其功能弱于preS/S启动子[5]。

3种HBV表面蛋白基因由S、preS2和preS1组成，因HBV基因型不同，preS1可编码108个、或118个、或119个氨基酸，为LHBs，在甘氨酸2位点为豆蔻酰化N末端，仅LHBs有此末端；preS2区长55个氨基酸，为MHBs，仅MHBs有乙酰化N末端；S区编码226个氨基酸[3]，为SHBs(图2)。

LHBs在20 nm球状颗粒上仅占1%～2%，但在丝状颗粒和完整病毒体中高达20%，含受体结合域，为感染肝细胞所必须，应用核苷(酸)类似物(NUC)治疗时，HBV量减少，LHBs也减少；MHBs在病毒体和2种亚单位颗粒中占5%～10%，其对HBV复制不起主要作用，在HBeAg 阳性患者中可检测到，但在HBeAg 阴性患者中很少检测到，表明MHBs与HBeAg表达相关；SHBs主要在HBV亚单位颗粒上，因此，NUC治疗不导致SHBs减少[3]。

注：a，LHBs、MHBs和SHBs基因结构；b，preS1和preS2区域结构。感染性区(2～77 aa)；感染-干扰豆蔻酰化前S1肽与假设的结合位点重叠；受体结合位点：关键的结合位点(9～18 aa)，辅助的结合位点(28～48 aa)；豆蔻酰化信号区(2～9 aa)；形成外膜的关键区：preS1(92～108 aa)与preS2(1～5 aa)。

2 HBV LHBs、MHBs和SHBs的检测方法

20世纪70年代初期，有研究[6-12]报告HBsAg是由若干种多肽组成，但由于研究方法不同，各报告的HBsAg多肽数量及其分子量不完全一致。1984、1987年，Heermann等[13-14]应用单克隆抗体蛋白印迹试验，发现HBsAg由GP42、P39、GP36、GP33、GP27和P24等 6种蛋白组成，GP42和P39为LHBs，GP36和GP33为MHBs，GP27和P24为SHBs(图2)。单克隆抗体A18/7为LHBs特异性抗体，其仅与LHBs起免疫反应，与MHBs和SHBs不起免疫反应；单克隆抗体Q19/10为MHBs特异性抗体，其仅与MHBs起免疫反应，与LHBs和SHBs不起免疫反应。因此，目前应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清LHBs和MHBs，即分别用A18/7和Q19/10单克隆抗体包被酶标板微孔，加入待检血清，如果待检血清中含有LHBs或MHBs，即与包被于酶标板微孔中的单克隆抗体结合，再加入酶标记的A18/7或Q19/10单克隆抗体(A18/7-HRP或Q19/10-HRP)，形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物，最后加入显色剂显色。根据颜色深浅度判定LHBs或MHBs含量。SHBs为间接计算获得，即总HBsAg量减去LHBs和MHBs量[15-19]。

3 检测血清HBV LHBs、MHBs和SHBs的临床意义

3.1 LHBs、MHBs和SHBs水平与HBV基因型有关 Peiffer等[20]对德国HBeAg阴性(HBV DNA<100 000 IU/mL、ALT<2倍正常值上限)A～E基因型慢性乙型肝炎(CHB)患者血清LHBs、MHBs和SHBs组成进行了比较，除B基因型LHBs比例高于MHBs以外，A、C、D、E基因型MHBs比例均高于LHBs；B基因型LHBs比例高于其他基因型；D基因型MHBs比例最高(图3)。

图3 HBV A～E基因型患者LHBs、MHBs和SHBs组成比较(引自参考文献[20])

Rinker等[17]比较了21例B基因型和49例C基因型HBeAg阳性CHB患者，B基因型患者LHBs比例较C基因型高2倍以上(13% vs 6%)。Pfefferkorn等[16]分析46例D和C基因型HBeAg阴性CHB患者血清LHBs、MHBs和SHBs组成，D基因型CHB患者LHBs和MHBs比例(7.1%±3.5%、3.1%±2.2%)均高于A基因型(5.4%±2.4%、2.4%±1.7%)，与Peiffer等[20]报告基本一致。

3.2 LHBs和MHBs消失可预测急性乙型肝炎康复 Gerken等[21]对20例急性乙型肝炎患者动态检测总HBsAg、LHBs和MHBs，其中16例检测到LHBs，15例检测到MHBs。其中，1例首份血清标本LHBs阳性但MHBs阴性患者，于发病后1周内HBeAg和总HBsAg均消失；50%的患者于发病后1周内MHBs阴转，50%的患者于发病后4周内LHBs阴转，所有MHBs和LHBs转阴患者总HBsAg均消失，表明为自限性急性乙型肝炎。对1例无并发症急性乙型肝炎患者的系列血清标本动态检测HBV DNA、HBeAg、抗-HBe、LHBs、MHBs和总HBsAg，结果显示，发病第1天即可检测到HBV DNA、HBeAg、LHBs、MHBs和总HBsAg，于发病后第3周和第4周MHBs和LHBs先后转阴，于发病后第4周HBV DNA检测不到，第18周总HBsAg消失(图4)。因此，MHBs和LHBs消失可预测急性乙型肝炎康复。Pfefferkorn等[19]报告，相较于LHBs，MHBs可以更早地预测HBsAg消失，与Gerken等[21]报告一致。

图4 1例无并发症急性乙型肝炎患者LHBs、MHBs和HBsAg动态变化(引自参考文献[21])

3.3 LHBs和MHBs可预测CHB患者HBsAg消失 Pfefferkorn等[19]对83例CHB患者进行回顾性分析，其中64例经NUC治疗，17例总HBsAg消失；19例经聚乙二醇干扰素α-2a(PEG-IFN-2a)治疗48周，3例HBsAg消失；63例总HBsAg未消失作为对照，检测总HBsAg消失与未消失组患者治疗前和治疗中血清LHBs、MHBs和SHBs水平。与总HBsAg未消失组比较，治疗前，总HBsAg消失组的MHBs中位数水平较低(P=0.005)；在治疗过程中，总HBsAg消失组MHBs和LHBs比例快速下降，但无血清学应答或只有HBeAg血清学转换的患者MHBs和LHBs比例无下降；经NUC获得总HBsAg消失的所有患者于治疗6个月时均检测不到MHBs，平均在总HBsAg消失前(12.8±8.7)个月MHBs即检测不到。应用受试者工作特征(ROC)曲线分析表明，NUC治疗前MHBs比例是总HBsAg消失最早的预测指标[ROC曲线下面积(AUC)=0.726，P=0.019]；经PEG-IFNα-2a治疗获得总HBsAg消失的患者，其MHBs和LHBs比例的动态变化相似。本研究表明，血清MHBs定量检测可预测NUC治疗应答。

Rinker等[17]对74例单用PEG-IFNα-2a和53例用PEG-IFNα-2a联合拉米夫定治疗HBeAg 阳性慢性乙性肝炎患者，动态检测总HBsAg、LHBs、MHBs、SHBs水平，结果发现，LHBs、MHBs和SHBs预测PEG-IFNα-2a应答并不优于HBV DNA、HBeAg、总HBsAg，与Pfefferkorn等[19]报告一致。

Zhu等[15]对41例经恩替卡韦治疗和21例经PEG-IFNα-2a治疗的HBeAg阳性CHB患者于基线和抗病毒治疗后4、12、24、36和48周定量检测LHBs、HBsAg和HBV DNA，结果发现血清LHBs水平与HBV DNA和HBsAg呈正相关(相关系数分别为0.635和0.588)；2组患者血清LHBs和HBV DNA水平下降显著，但HBsAg下降缓慢；PEG-IFNα-2a组于治疗第4周血清LHBs为88.46 ng/mL的病毒学应答的阳性和阴性预示值分别为88.9%和100%，优于预测恩替卡韦治疗应答；联合LHBs、总HBsAg和HBV DNA可更好地预测病毒学应答和血清学应答。该结果与Rinker等[17]和Pfefferkorn等[19]报告不完全一致，可能与检测方法不同有关。因此，需对LHBs和MHBs检测方法进行标准化。

3.4 治疗过程中MHBs升高可能与肝细胞癌(HCC)有关 Brancaccio等[18]对30例乙型肝炎肝硬化患者随访38(12～48)个月，其中13例发生HCC。发生HCC患者与未发生HCC患者入组时的LHBs、MHBs和SHBs中位数水平无差异；在治疗过程中，发生HCC患者与未发生HCC患者的SHBs下降>25%或持续稳定的比例相似，分别为58.3% vs 47.1%(SHBs下降>25%)和25% vs 29.4%(SHBs持续稳定)；相反，发生HCC患者MHBs水平升高>25%比例高于未发生HCC患者，分别50% vs 11.8%(P=0.02)；发生HCC患者与未发生HCC患者的LHBs动态变化无差异。因此，在治疗过程中，动态检测MHBs可确定发生HCC的风险，其机制尚需进一步研究。

3.5 LHBs或MHBs检测可确定非活动期HBV感染 Pfefferkorn等[16]对14例急性HBV感染、44例非活动期HBV感染、46例HBeAg阴性CHB、68例HBeAg阳性CHB和11例HBV/HDV合并感染患者应用preS1和preS2 ELISA法检测LHBs和MHBs，应用商品试剂定量检测总的HBsAg，结果显示，不同期HBV感染者的表面蛋白组成不同，非活动期患者的LHBs和MHBs比例低于其他各期(P<0.000 1)；HBV/HDV合并感染患者的LHBs高于其他各期(P<0.000 1)；ROC曲线分析表明，LHBs、MHBs和总HBsAg确定非活动期HBV感染的AUC分别为0.89、0.73和0.62，表明LHB和MHBs确定非活动期HBV感染的敏感度和特异度优于HBsAg。

4 小结

总HBsAg由LHBs、MHBs和SHBs组成；LHBs、MHBs和SHBs水平与HBV基因型有关；LHBs和MHBs消失提示急性乙型肝炎康复；MHBs显著下降可预测NUC治疗应答和HBsAg消失；治疗过程中MHBs升高可能与HCC发生有关；非活动期HBV感染患者的MHBs和LHBs水平较低，用其确定非活动期HBV感染优于总HBsAg；HBV/HDV合并感染者LHBs水平较高。但当前，关于LHBs、MHBs和SHBs临床意义的研究仍较少，亟需进一步探讨。

利益冲突声明：作者声明不存在利益冲突。