肝细胞癌多组学分子分型及其在精准诊疗中的应用

董良庆，高 强

复旦大学附属中山医院，复旦大学肝癌研究所，上海 200032

全球癌症发病率和死亡率仍处于上升阶段，已成为全球第三大死因[1]。在我国，肝细胞癌是高发恶性肿瘤之一，发病率占全球近50%，70%～80%的患者首诊即是晚期，是我国第三大癌症死因[2]。尽管外科治疗、介入、放疗等传统疗法以及靶向、免疫治疗等创新疗法均取得了显著的进步，肝癌总体生存期仍有待于进一步改善[3]。目前，肝癌的治疗仍然面临“预防难，发现晚，靶点少”的严峻挑战，被寄予厚望的靶向免疫治疗的整体应答率低且在患者间差异巨大，其原因包括目前对肝癌分子亚型及驱动事件等认知尚不足，以及体内外高通量药物筛选等存在技术性限制。此外，肝癌患者可能有多种药物治疗选择，但最佳治疗药物和组合等仍缺乏有效生物标志物用以有效预测疗效或提供用药指导。近年来，高通量分子生物学技术以及平行检测技术的进步和普及，使得从多维度、多组学、多系统来综合揭示肝癌发生机制和驱动事件，并开发新的精准诊疗策略成为可能。本文简要回顾了近年来肝癌的治疗进展，详细探讨了应用多组学的新技术和策略鉴定潜在治疗靶点及治疗应答标志物，以及指导肝癌患者治疗方案选择。

1 肝癌治疗的现状和困境

肝癌主要危险因素包括HBV/HCV慢性感染、酒精性肝炎、代谢综合征以及非酒精性脂肪肝[4]。对于早期肝癌患者，手术切除仍是目前的一线选择，其5年生存率在笔者中心已超过70%。对于肝功能储备不足或肿瘤位置不适合手术的患者，射频消融及肝移植是潜在治愈性疗法，但存在供肝可用性以及肿瘤负荷超过移植标准等诸多限制[5]。大多数肝癌患者确诊即为晚期，因此上述治愈性疗法并不适用[6]。2017年之前，多受体酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase imhibitor，TKI)索拉非尼仍是唯一确认可为晚期肝癌患者带来生存获益的疗法[7-8]。近几年，肝癌的靶向和免疫治疗取得了显著进展，多种新药被证实对晚期肝癌有效。就TKI而言，已有一线治疗仑伐替尼[9]和多纳非尼[10]，以及二线治疗瑞戈非尼[11]、卡博替尼[12]和阿帕替尼[13]。TKI通过靶向抑制多达40余种激酶，有效抑制肿瘤细胞生长，并实现免疫微环境平衡[14]，包括血管生成(如VEGFR和PDGFRβ)以及细胞增殖相关(如BARF、KIT和RAF1)等位点，但由于TKI药理学的复杂性和位点的多样性，目前尚未发现可有效预测TKI应答疗效的生物标志物。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)更是在肝癌患者中显示出令人鼓舞的疗效，多种ICI单药已被批准用于肝癌二线治疗，包括纳武单抗(PD-1)[3]、派姆单抗(PD-1)[15]、卡瑞丽珠单抗(PD-1)[16]、替雷利珠单抗(PD-1)[17]和阿维单抗(PD-L1)[18]。特别是ICI的免疫联合疗法在患者中实现了更大的生存获益，包括阿替利珠单抗(PD-L1)联合贝伐单抗(IMbrave150)[19]、信迪利单抗(PD-1)联合贝伐单抗(ORIENT-32)[20]以及度伐利尤单抗(PD-L1)联合曲美木单抗(CTLA-4)(HIMALAYA)[21]。上述不同机制的药物通过抗肿瘤-免疫或者免疫-免疫等强强联合，作用机制互补，是未来肝癌药物治疗的重要发展方向。

随着肝癌不同作用机制药物治疗的快速发展，亟需对肝癌展开全面的分子层面分析，亚组生物特征、标志物筛选，以及治疗应答差异数据库的构建，从而针对每个患者快速遴选最优的用药策略[22-23]。由于这些药物可能涉及肿瘤代谢、血管生成、免疫调控等多维度干预，因此需要整合多学科和交叉应用思维，从更广泛维度分析并验证肿瘤-免疫应答特征——从全肿瘤组织测序到单细胞研究，从癌细胞到微生物组学，从肿瘤细胞系到转基因小鼠和个体化患者模型，从单个时间点到时空异质性分析。庞大的分子图谱数据集合描绘了肝癌发生发展的生物机制，并为合理治疗靶点选择和治疗分层提供重要指导。在此，本文将关注于当前肝癌研究中的大队列、时空多位点样本、多组学研究，并探究如何将组学数据应用于指导治疗和筛选生物标志物。

2 基因组分型是肝癌精准医学的起点

随着2001年人类基因组计划的完成，从基因组维度解析生理和疾病状态下的生物学过程，精准肿瘤学和个体化医疗概念由此诞生。肝癌的发生是一个复杂的多因素多步骤过程，约80%的患者在慢性致病因素(如肝炎、药物性或酒精性)影响下获得不同的病理、基因组及微环境改变，逐步过渡形成硬化结节最终发展为肝癌[24]。高通量基因组分析等技术的发展使我们对肝癌发生发展机制以及患者分子分层有更深入认识，也是肝癌精准治疗的基础和开端。

2.1 以基因组、转录组和临床特征为核心的肝癌分子分型 肝癌基因组主导肿瘤驱动模式以及临床病理特征，目前已有超过千例肝癌患者的基因组被测序和分析[25-32]，发现肝癌中的高频突变的驱动基因包括TERT(44%的肝癌肿瘤中存在突变)、TP53(31%)、CTNNB1(27%)和ARID1A(7%)；拷贝数分析揭示了28个高频局灶性扩增，包括已知的癌基因CCND1、FGF19、MYC、MET、VEGFA和MCL1[33]。通过整合病因、突变谱、表达谱、临床特征等信息，多项研究中提出了将肝癌患者分为增殖型和非增殖型[24,34-35]，其中增殖型与HBV感染相关且预后较差，表现为细胞增殖和生存相关通路的激活，如PI3K-AKT-mTOR、MAPK和MET级联通路等，进一步可将增殖型肝癌细分为2个亚型：S1类表现为WNT-TNFβ激活；S2类表现为WNT的非经典激活以及高表达EPCAM和AFP。非增殖型患者侵袭性相对较低预后更好，主要富集了丙型肝炎病毒感染及酒精代谢相关的肝癌。2017年TCGA肝癌研究[33]进一步完善了该分型，通过对363例患者的基因突变、DNA拷贝数变化、DNA甲基化水平、mRNA表达、microRNA表达和反相蛋白阵列(RPPA)数据进行无监督聚类(iCluster)，揭示了3种具有独特分子特征的亚型以及亚型对应的治疗策略，其中iClust1亚型与增殖-S2具有相似的祖细胞(表达EPCAM)等特征；iClust2与非增殖型具有共同的分子和病理特征，包括CTNNB1突变以及较少的微血管侵袭；iClust3则是TCGA鉴定的新亚型，主要具有染色体不稳定性和TP53突变等增殖型S1的部分特征，同时具有M2巨噬细胞浸润以及免疫耗竭等特征，是预后最差的一个亚型。

肝癌是一种典型的炎症相关癌症，病毒性肝炎或者脂肪性肝炎等是重要的慢性病因，因此肝癌微环境中存在多种免疫细胞与癌细胞的复杂相互作用[36]。通过对炎症相关基因表达、免疫细胞浸润以及免疫调控配体等对肝癌进行基于免疫状态的分子分型[37]，发现仅30%的肝癌患者具有较高免疫水平，具体表现为高免疫细胞浸润、IFNγ信号激活、颗粒酶B和穿孔素等细胞溶解标志物的高表达；另有25%患者肝癌表现为“免疫荒漠”型，缺乏多种免疫细胞浸润，有趣的是该亚型与上述CTNNB1突变的非增殖亚型高度重合。

2.2 肝癌遗传异质性影响治疗策略的开发 肝癌是高度异质性的肿瘤，各亚克隆群可是因肝硬化背景而从不同克隆独立发展而来，也可能是由单个原始病灶转移形成，在这个过程中肿瘤克隆群异质性受肿瘤进化及免疫微环境的双重自然选择[38]。肿瘤异质性主要包括时空异质性[38]、肿瘤内异质性[39]、肿瘤间异质性[38]以及患者间异质性[33,40-41]。异质性越高的肝癌患者预后相对更差，且治疗选择也更加复杂[38]。

为了克服肿瘤内异质性，目前治疗策略主要从两方面入手：一方面，靶向肿瘤中所有亚克隆群，通过阻断主克隆或者联合药物阻断分支克隆将可能产生临床获益。85%肝癌的主克隆突变主要集中在TERT、TP53和CTNNB1，这些突变存在于同一肿瘤不同区域以及原发灶和转移灶之间[42]。尽管上述基因靶点因高频性和时空分布特点具有重大潜在价值，遗憾的是，目前精准靶向这些驱动变异仍较为困难，TP53突变目前认为是不可成药的，靶向其上下游信号调控分子(如MDM4或MDM2)具有药物开发潜力[43-44]。此外，多种靶向亚克隆的新型治疗策略尚在开发，包括应用小分子药物和反义寡核苷酸，如利用GRN163L来靶向TERT的RNA模板区域，能够有效抑制肝癌生长[45]。笔者团队[39]通过构建肝癌不同位点原代细胞株，应用高通量筛选联合靶向多分支变异的研究策略，在体外成功阻断了肿瘤演化进程。另一方面，充分调动肝癌克隆群间相互竞争以及增强灵活多样的免疫筛选压力来控制肿瘤也是重要的突破口，肝癌不同克隆群间存在相互竞争[46]，通过间歇性调动肿瘤内不同克隆群促使其相互竞争，达到并维持克隆竞争“平衡点”将可能实现长期带瘤生存[47]；此外，针对主干变异或者不同分支变异单独设计肿瘤疫苗或者筛选特异性T淋巴细胞等免疫策略，可实现精准杀灭各亚克隆群[38]。当前，迫切需要进一步阐明肿瘤内异质性的机制以及对不同治疗策略的影响，探索如何克服肿瘤异质性进而阻断肿瘤进化中的阳性选择，基于不同肿瘤克隆结构和演化特征开发个体化治疗策略，从而最大化延长患者生存获益。

3 蛋白基因组学的综合策略助力肝癌精准诊疗

基因组的研究系统阐明了肝癌的遗传变异，但单纯基因组研究存在较大局限性，一方面，基因组主要反映肿瘤细胞自身变异，但目前阶段大部分肝肿瘤突变缺乏有效的靶向干预药物，且基因组对肿瘤间质及免疫组分解析有限；特别是肝癌这类由慢性肝炎逐步诱发的肿瘤，致癌环境的影响会远早于基因组变异[41]。另一方面，基因变异并不完全反映到蛋白质层面，从基因改变到实现其生物学效应要经历一系列生物学过程的调控，其功能的执行通常需要翻译形成蛋白质，其中转录后以及翻译后调节修饰对实际效应蛋白均会产生显著影响。近年来以蛋白基因组为核心的多组学研究蓬勃开展，包括中国人蛋白质组计划、美国临床蛋白组肿瘤分析联盟以及国际蛋白基因组联盟等，并在结直肠癌[48-49]、肺癌[50-51]、肾癌[52]、卵巢癌[53]、乳腺癌[54]、子宫内膜癌[55]、肝细胞癌[40-41]、肝内胆管癌[56]、胃癌[57-58]、头颈癌[59]等多癌种的蛋白基因组图谱描绘中取得重大突破。整合基因组、转录组、蛋白组、蛋白修饰组及代谢组等多组学数据将有助于多维度全面解析肝癌的发生发展机制，从基因型分析逐步深入到蛋白质组表型，并与基因组数据互补，为肝癌的精准分型与个体化治疗、疗效监测、预后判断等提供新的思路和策略。

3.1 蛋白基因组分型更精细化解析肝癌特征 鉴于蛋白组学在肝癌中巨大价值和转化应用潜力，多项研究基于此策略进一步解析了肝癌特征。2017年TCGA通过RPPA蛋白组技术初步探索了肝癌蛋白谱特征[33]。2019年，Nature发表的一项研究[40]基于110个早期肝癌的定量蛋白质组学数据将队列分为S-Ⅰ、S-Ⅱ和S-Ⅲ亚型，其中预后最差的S-Ⅲ主要表现为胆固醇代谢紊乱，该亚型特异性高表达的甾醇O-酰基转移酶1可改变细胞内胆固醇分布并促进肝癌增殖和迁移；而S-Ⅰ和S-Ⅱ相对侵袭性较低，S-Ⅰ主要表现为解毒和尿素循环等肝细胞相关特征，S-Ⅱ表现为增殖特征。我国肝癌多是由慢性乙型肝炎肝炎基础上发展而来，同期笔者团队[41]对159例乙型肝炎相关肝癌患者进行蛋白基因组学研究并分为3个亚型：代谢驱动型(S-Mb)、微环境失调型(S-Me)和增殖驱动型(S-Pf)；S-Mb的特征是肝脏代谢相关蛋白的表达水平高且突变负荷最高；S-Pf具有癌栓且增殖相关信号通路异常激活，预后最差；S-Me的特征是免疫、炎症分子表达下调；大部分的潜在药物靶点富集于S-Pf和S-Me，包括大量涉及增殖和侵袭的调控因子；该研究鉴定出2种差异代谢酶二氢吡咯-5-羧酸还原酶2和乙醇脱氢酶1A可作为独立的肝癌预后生物标志物。

基因拷贝数改变是由肿瘤基因组不稳定引起，对mRNA、蛋白和磷酸化蛋白的丰度产生了多元影响，主要包括顺式调控和反式调控。反式调控的蛋白主要富集于大型蛋白质复合物上，如核糖体和剪接体，可能是由于这些蛋白的翻译后修饰等导致蛋白质丰度与拷贝数改变的关联性减弱，这突出了蛋白质组学数据在肝癌靶点发现和治疗选择中的重要性。多项研究[40-41,60]也发现蛋白质在mRNA和蛋白质丰度改变之间并非是线性的，而是处在复杂的调控网络之下。

3.2 蛋白基因组学有助于药物应答监测 多项临床研究尝试根据生物标志物对患者分层以进行精准治疗。在Ⅱ期研究的回顾性分析中，发现RAS通路激活的晚期肝癌患者对瑞法替尼(MEK抑制剂)和索拉非尼的组合表现出最佳的临床反应[61]。研究[62]发现Fms样酪氨酸激酶3激活状态可作为索拉非尼在晚期肝癌患者应答中的预测标志物。结节性硬化症复合体1和2是mTOR通路中的高频突变基因，其突变降低mTOR通路活性并促进肝癌进展[63]，研究[64]表明该突变亚群患者对mTOR通路抑制剂雷帕霉素较为敏感。此外，基于蛋白基因组为核心的多组学对肿瘤免疫微环境全方位动态监测有助于预测肿瘤免疫治疗效果，以及解析治疗应答和耐药机制，如已有多项研究报道肿瘤突变负荷、抗原提呈通路变异以及T淋巴细胞活性状态等因素影响黑色素瘤对ICI治疗应答[65-67]：2017年发表的多组学探究纳武单抗治疗期间肿瘤及微环境演化机制[68]、2019年利用转录组+多重免疫荧光+流式质谱技术解析免疫亚群用以预测ICI治疗应答[69]、2021年发表的利用多组学探究纳武单抗对肾癌治疗应答影响因素[70]等。

目前，针对肝癌批准的一线用药TKI均是以多个激酶蛋白为最终靶点，由于靶点广泛，目前从基因组角度很难界定与TKI应答相关的突变事件。除了对肿瘤细胞的作用，TKI通过影响肿瘤微环境、血管生成和激酶信号通路等多种途径发挥抗肿瘤效应[71-72]。通过CRISPR-Cas9敲除筛选等高通量技术发现EGFR通路反馈激活将限制肝癌对仑伐替尼的应答，提示EGFR通路激活患者可尝试EGFR通路抑制剂和仑伐替尼联合治疗[73]。在治疗过程中，蛋白基因组技术能较好区分EGFR通路状态以及下游磷酸化水平的动态改变，分析肿瘤微环境组分，从而预测TKI疗效以及耐药发生。因此，以蛋白基因组为核心的多组学研究将促进肝癌高通量靶点的相关研究，将全面解析肝癌患者的不同临床分组以及亚组患者的分子特征，指导不同药物选择和预后预测，也将为现有标准治疗提供有力的监测手段。

4 基于分子分型的肝癌精准治疗新策略

4.1 临床前模型加速个体化精准治疗靶点的选择

尽管靶向和免疫治疗在肝癌中已取得巨大成功，但肿瘤样本受限于组织量及活性等因素，患者最佳治疗方案选择和应答预测等模型仍然缺乏，是目前探索多组学分子分层精准治疗的主要障碍。构建具有患者遗传和微环境背景的临床前模型以最大程度再现肝癌整体异质性和复杂性至关重要。

4.1.1 成熟的肝癌细胞系组学平台用于药筛研究 具有原发肿瘤大部分遗传和表观变异的细胞系，是目前癌症药物应答研究中最被广泛使用的模型。原代肝癌细胞系在体外筛选药物靶点及动态监测耐药性改变方面优势明显，2019年一项研究[74]中构建了50个低传代数的患者来源的肝癌细胞株模型，结合基因组和转录组数据以及体外高通量药物筛选，大规模快速鉴定适合于不同遗传背景的治疗靶点，为对应患者临床用药选择提供潜在参考；同时，基于多点取样及多时间点取样策略，笔者团队构建时空异质性细胞系并阐明了肝癌克隆演化机制以及耐药性改变[39,47]。

癌细胞系百科全书(cancer cell line encyclopedia，CCLE)为代表的泛癌种细胞系研究计划在2012年—2020年对约1000个肿瘤细胞系(其中包含25个肝癌细胞系)进行基因组、转录组、蛋白质组学、亚硫酸氢盐甲基化测序、全局组蛋白修饰谱和代谢物谱等多组学分析，有机整合了各细胞系药物应答数据以及CRISPR全基因组筛选等数据，极大地拓展了对肿瘤生物学认识，为肿瘤细胞系功能组学以及体外靶点筛选提供了重要组学平台数据[75-78]。然而，细胞系模型存在诸多缺陷，如与其他细胞系交叉污染[79]、长期培养后遗传背景漂变，依赖于细胞增殖来评估药物应答，粘附于培养皿影响细胞信号传导、增殖和凋亡等功能[80]。尽管原代细胞株在保留肿瘤微环境及异质性方面存在先天不足，它仍然是当前肝癌药物高通量筛选的重要基础，药物应答数据也是药物开发和患者选择的重要参考。

4.1.2 具有三维结构的类器官保留更多肿瘤特征 类器官因其能更好地保留原始肿瘤的三维空间组织结构、多向分化能力以及细胞间相互作用，从更多维度评估药物对肿瘤的影响，如增殖、形态、粘附、信号传导以及细胞-微环境相互作用等，近年来被用以研究包括癌症发生、转移和药物筛选等多种科学问题[81]。2017年，Broutier等[81]成功构建了3种最常见的肝癌的类器官(肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌-胆管癌混合癌)并进行了29种化合物药物敏感性筛选，最终鉴定出ERK抑制剂SCH772984可能作为肝癌的潜在治疗药物。2018年Nuciforo等[82]利用肝癌活检微量组织成功构建了具有肿瘤内异质性的类器官，体外实验表明其对索拉非尼具有不同的药物敏感性，将类器官接种免疫缺陷鼠后成功复现了其亲代肿瘤的组织学和基因组特征。近期，Tienderen等[83]评论，标准化高效化的类器官构建及多组学表征将促使肝胆类器官在个体化治疗中构筑坚实的应用基石。但目前类器官也存在一些问题，例如成本高、制备耗时且困难，且缺乏免疫组分和肿瘤间质成分，尚不能完全模拟临床肝癌全部特征,若要应用于免疫治疗筛选以及抗血管生成等药物测试仍需进一步完善[84]。

4.1.3 小鼠等动物模型的合理应用和开发 小鼠模型主要包括患者来源肿瘤异种移植物(patient-derived xenograft，PDX)、基因编辑小鼠模型 (genetically engineered mouse models，GEMM)和致癌物诱导模型(chemically induced models，CIM)，其中GEMM和CIM分别被广泛用于不同遗传背景和不同病因下肝癌发生发展的体内研究。如基于临床大样本鉴定肝癌驱动基因，并构建具有特定遗传背景的GEMM小鼠模型，包括过表达癌基因(如Myc和β-catenin)、过表达生长因子(如EGF和TGFβ)以及破坏抑癌基因(如p53)[85]，有助于揭示这些驱动基因在肝癌发生发展、治疗应答和耐药中的关键作用[86]；2004年的一项研究[87]比较了7个小鼠肝癌模型与91个人肝癌样本的转录水平差异,发现Myc、E2f1和Myc+E2f1的转基因小鼠与预后好的肝癌患者之间存在更高相似性，提示特定突变背景的小鼠模型能有效代表特定亚群的肝癌患者。此外，GEMM和CIM更重要的是两者存在完整的免疫组分，是重要的免疫治疗临床前模型，可为该驱动基因亚型患者的免疫联合治疗药物选择提供机制参考。而PDX模型可最大限度保留患者肿瘤组织形态、分子和遗传异质性[88]，可以有效的监测肿瘤生长以及评估疗效，但受限于操作及小鼠肿瘤生长周期等，目前PDX药物筛选通量低、耗时长，很难在临床实践中推广。随着更多的小鼠肝癌模型的开发，人肝癌发生发展规律将获得更全面更精确的模拟，为转化研究提供充分的临床前药物测试系统。

4.2 基于蛋白组挖掘新的潜在治疗靶点及进展

尽管近年来已从多维度揭示了肝癌的分子特征，包括高频驱动变异(TERT启动子、TP53和CTNNB1)、染色质拷贝数变异(1q和8q扩增，4q/8p/16p/17p丢失)以及通路失调(WNT通路、mTOR以及MAPK级联通路等)[33,40-41]，对这些分子驱动因素的理解尚未转化为生物标志物驱动的精准医学实践。除了目前的ICI以及TKI外，针对肝癌其他驱动通路相关的药物试验也在积极开展中，包括且不限于以下的靶点。

4.2.1 MET抑制剂 MET通路激活参与了肝癌恶性转归和治疗耐药，常发生激活突变以及扩增[41]，研究[89]发现MET激活与患者预后不良显著相关且靶向该通路可改善患者预后，因此MET被认为是肝癌重要的潜在治疗靶点。然而，在一项包含1209例接受过索拉非尼治疗后耐药肝癌患者的Ⅲ期临床试验[90]中，MET小分子抑制剂Tivantinib并未显著延长患者生存，这对MET通路是否适合作为肝癌治疗靶点提出了重大挑战。后续的多项研究关注于寻找特异性更强的MET抑制剂(如卡马替尼)[91]，亦或是聚焦于MET抑制剂(卡马替尼)与ICI类(PDR001)联合使用(NCT02795429)。MET抑制剂在肝癌治疗体系中的作用仍需要后续进一步研究确认。

4.2.2 FGFR4激酶抑制剂 FGF家族由至少5个酪氨酸激酶和大量同源配体组成，尽管FGFR2变异及融合是肝内胆管癌等癌症中一个重要的治疗靶点[56]，但肝细胞癌主要表达FGFR4且其配体FGF19在11%肝癌患者中发生扩增[41]，两者结合并激活肝癌FGF19/FGFR4信号可诱导肿瘤细胞增殖[92]，并促进肝癌对索拉非尼发生耐药[93]。多个早期临床试验验证了几种FGFR4激酶抑制剂的安全性和临床耐受，包括BLU-554(NCT02508467)[94]、H3B-6527(NCT02834780)[95-96]以及FGF401(NCT02325739)[97]，大部分不良反应都是Ⅰ～Ⅱ级，包括腹泻、恶心和呕吐等，BLU-554在FGF19免疫组化阳性的晚期肝癌患者中整体应答率达到17%，中位缓解持续时间5.3个月[94]，这些结果初步印证了FGFR4通路在肝癌中的致癌驱动作用以及FGF19表达量可作为FGFR4激酶抑制剂应答预测的生物标志物。

4.2.3 mTOR通路抑制剂 mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于mTORC1和mTORC2 2种复合物中，并作为一种主要的生长调节分子参与了肝癌发生相关的下游酪氨酸激酶信号传导[63]。依维莫司是一种mTORC1变构抑制剂，在Ⅲ期临床试验[98]中并未改善肝癌患者生存。目前临床开发中的mTOR通路抑制剂一方面通过作用于更多靶点，实现更广泛的mTOR-PI3K-AKT通路抑制，如mTORC1和mTORC2双抑制剂(如ATG-008和sapanisertib)以及mTOR-PI3K抑制剂(如GSK2636771、SF1126和capivasertib)，另一方面mTOR通路抑制剂与其他药物联合使用，包括SF1126联合纳武单抗(NCT03059147)、依维莫司联合RTK(NCT04803318)[99]。PI3K/Akt/mTOR 通路抑制疗法目前主要面临着通路反馈激活其他替代通路从而耐药的问题，因此需要密切监测肿瘤信号通路的改变并阻断替代通路实现最大疗效。

5 展望

以蛋白基因组为核心的多组学以及高通量临床前模型的发展和应用将有助于肝癌患者临床精准诊疗实施，为开发个体化治愈性疗法提供潜在机会。在可预见的未来，多组学工具将应用于更多的研究以探索肝癌发生发展机制，评估针对特定肝癌患者亚型的分子途径及新药疗效[100]。通过亚型特异性靶向策略，例如靶向特定的致癌通路可将侵袭性强的肝癌亚型转化为另一种侵袭性较低的亚型。对肿瘤微环境的多维度监测将可识别出更准确的预后生物标志物。随着技术的蓬勃快速发展，基于多组学的肝癌精准诊疗有望在以下方面取得重要突破。(1)可靠的肝穿刺活检样本多组学检测技术：2020年，Satpathy等[101]对HER2靶向治疗前后HER2阳性乳腺癌患者的针芯活检进行了全面的非靶向蛋白质基因组学分析，发现HER2靶向治疗后，有响应患者肿瘤的HER2蛋白磷酸化减少，而无响应患者则出现多重HER2靶向耐药因素。因此，该技术的发展将极大推进肝癌分子状态监测，可能寻找到克服肿瘤进展、治疗耐药的新方法。(2)靶向蛋白质组学将多组学带入精准诊疗临床实践：基于大样本队列构建用于潜在药物应答以及预后预测的靶点模型，可通过应用靶向蛋白质组学(低成本、高可靠性)将模型引入临床实践，一方面能显著提升对低丰度样本的解析[102-103]，另一方面可对多种不同状态组织开展检测，包括血清、血浆、冷冻组织和石蜡标本[104]，同时还将有助于药物以及临床检测肿瘤特异性蛋白流程开发[105]。(3)基于蛋白基因组驱动分子分层的精准诊疗：蛋白质基因组学极大推动了癌症分子及组织学分型，可针对特定分子亚型肝癌驱动及通路开发对应的治疗策略，并据此开展相应的临床试验研究[106]。精准肿瘤学将在未来肝癌研究和临床应用领域不断发展，多中心、多组学、大队列肝癌数据的解析和高通量、多平台验证技术的发展，有望为患者精准的药物靶点选择和优化提供重要支撑。同时，对来自肿瘤活检、治疗前后和原发复发样本进行多组学分析，有助于监测肿瘤亚克隆演化，进一步加深对基因型-表型相关性以及治疗敏感和耐药机制的理解。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：董良庆负责文献分析，论文撰写；高强负责指导写作，最终定稿。

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