肝胆肿瘤模型与精准药物筛选新技术

刘 壮，高 栋

细胞生物学国家重点实验室，上海市分子男科学重点实验室，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，上海 200031

1 基于个性化病理模型的药物筛选技术

肝胆肿瘤是临床最致命的肿瘤之一，但目前针对患者选择特异性药物缺乏明确依据，肿瘤位点检测又常因为其异质性受到影响，因此，建立可靠的、可用的体外筛选模型至关重要。肝的人体肿瘤组织小鼠移植(patient-derived xenografts,PDX)模型是一种传统的个性化病理模型，具有特异性强、与临床效果一致性高等优势。因此，借助PDX模型进行精准的药物筛选在当前广泛应用。

PDX模型是将取自临床患者的手术或者穿刺取得的肿瘤组织直接异位移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的动物病理模型[1]。相较于其他类型动物模型，PDX模型可以更大程度上有效反映人类原发肿瘤的微环境，即细胞组成(如淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及其他各类细胞等)以及细胞外基质，能够更好地展现肿瘤细胞与周围基质之间的密切联系和相互作用，在模拟人体肿瘤组织微环境的重构及血管的生成、肿瘤细胞的发生发展甚至肿瘤的转移逃逸等方面具有明显的优势[2-3]。同时，由于PDX模型能够保留原代肿瘤的遗传学特征(特异性突变、基因组整体特性等)，因而可作为筛选抗癌药物、评价药物的临床疗效及检测药物毒性有效工具[4]，作为一类特异性的模型，其还可准确反映不同个体肿瘤间和肿瘤内的异质性[5]，在药物效能研究、患者治疗后临床效果及预后预测等方面优势明显[6]。PDX模型还能够保留不同患者原代肿瘤的特性并可在免疫缺陷小鼠上对原代肿瘤进行传代，可作为肿瘤个性化治疗的研究标本[7]。因此，肝细胞癌PDX模型在药物和生物标志物筛选及联合临床试验中显示出作为临床前模型的优势。

PDX模型多用于肝细胞癌的发病机制并据此进行药物筛选的研究。Kissel等[8]以瑞戈非尼和索拉非尼为模型药物，比较了H129小鼠肝癌模型和PDX模型对抗肿瘤药物的敏感性差异。Lv等[9]利用肝癌细胞系和PDX模型评价了维他命C通过SVCT-2对肝细胞癌的抑制作用。Matsuki等[10]应用2个PDX模型证实了新型分子靶向药物仑伐替尼具有通过抑制 FGF信号通路活性抑制肝细胞癌的增殖、转移及侵袭等作用。PDX模型广泛用于肝细胞癌的临床前抗肿瘤药物疗效方面的研究，一些临床前抗肿瘤药物疗效评估的效应也依赖于PDX模型，能够对肝细胞癌的临床治疗提供指导，同时对于新药的研发和应用具有重要意义。目前，索拉非尼是抗肝细胞癌的一线药物，以索拉非尼为代表的分子靶向药物在进展期肝细胞癌治疗中发挥了重要作用，其抗癌机制是通过抑制多种丝氨酸/苏氨酸和受体酪氨酸激酶，从而抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡等方面发挥作用，进而达到有效杀伤肿瘤细胞的目的[11]。虽然索拉非尼能够显著延长部分肝细胞癌患者的生存期，但还存在未能抑制的信号通路，如磷化硫醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路[12]，这些信号通路反过来能够促进索拉非尼耐药细胞的生长和存活，从而出现更加难以克服的耐药现象。研究者利用PDX模型对索拉非尼的抗癌机制以及在抗癌过程中可能会影响其作用的生物标志和信号通路进行了深入研究，同时也对开发其他抗肝细胞癌的药物和成分展开了研究。Wu等[13]通过建立PDX模型证实了利用CDK1抑制剂阻断CDK1/PDK1/β-Catenin信号通路能够增强索拉非尼的抗肿瘤应答。利用PDX模型研究[14]发现，抑制胰岛素样生长因子受体1的活性能够显著增强索拉非尼抑制肝癌细胞生长和存活的作用。Liang等[15]应用PDX模型验证pERK是评价索拉非尼治疗肝细胞癌时一项显著的生物标志物。当索拉非尼通过RAF/MEK/ERK通路发挥作用时，pERK会出现显著下调。通过构建肝细胞癌PDX模型研究索拉非尼耐药组与敏感组中DKK1的表达差异，发现通过降低DKK1表达可增强索拉非尼的敏感性[16]。PDX模型因保留患者肿瘤的分子特性和异质性，能够再现患者的药物敏感性特征，被广泛应用于肝细胞癌临床前药物敏感性研究。许多研究发现，PDX模型对抗癌药物的反应与提供肿瘤样本的实际患者反应相似[17]。因此，PDX模型有助于测试某些药物的治疗反应，并且可以从异种移植组织获得治疗后数据[18]。Wang等[19]利用PDX模型证实纳米药物SN38治疗肝细胞癌的作用，研究发现优化后的药物递送结构可以更好地对肝肿瘤进行杀伤。Gu等[20]开展了临床前研究分析65个PDX模型基因表达的差异以及包括索拉非尼等药物在内的PDX对药物反应性。Xin等[21]利用PDX模型得到LIXC002、LIXC003、LIXC004、LIXC006、LIXC011、LIXC012以及CPL0903在内的7种新的人来源肝细胞癌细胞系，并对每个细胞系的药物敏感特性进行检测分析对比。可以预见的是，在肝胆肿瘤治疗的层面，PDX模型仍然具有巨大的发展前景和应用潜力。

生物学基础研究和疾病诊疗应用研究均离不开合适的研究模型。经典的二维(2D)培养人源细胞模型极大的促进了生物学基础研究和疾病诊疗应用研究的进展，但是这种模型同时也存在严重缺陷。2D细胞培养往往细胞类型单一，不能全面反映细胞在体内的特征，难以反映特异性与个性化的特点[22-24]。类器官模型是近年来新出现的生物学研究模型，兼具2D细胞培养的简单操作特性和PDX模型的复杂结构特征，是极佳的生物学基础研究和疾病诊疗应用研究模型。类器官是由不同谱系来源的细胞，在三维培养条件下自发形成类似体内组织结构的多细胞团，具有自更新和自组织能力，并可以在一定程度上维持其来源组织的生理结构和功能[25]，是开展肿瘤生物学和干细胞生物学研究的有力工具。类器官模型在研究组织构建与再生，疾病发生、发展和治疗等方面都具有独特优势，例如能够长时间体外增殖，很好地保持了组织生理和病理状态下的组织结构和细胞异质性[25-28]，适用于大规模的药物筛选[25,28]，在新型药物的筛选中有着广阔的应用前景。

肿瘤异质性是指在同一肿瘤组织内部或者不同的肿瘤来源的组织之间存在着的遗传及病理差异[29]，这种特性是临床治疗肿瘤需要考虑的关键因素。肝癌在肿瘤的发生机制、临床患者的组织形态、肿瘤微环境，以及遗传分子特异性层面均表现出高度异质性[30]，因此迫切需要开发出能稳定维持肿瘤细胞体内特征的肝癌研究模型用于肝癌的个体化精准诊疗研究。原发性肝癌主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌、混合型肝细胞癌-胆管癌3种亚型。2017年，Broutier等[31]利用肝癌患者临床肿瘤切除组织生成了3种原发性肝癌类器官，该模型较好地保留了原发肿瘤的组织学结构、基因表达和基因组特征，并在相同培养基条件下长期传代仍可保留不同肿瘤组织结构和亚型。异种移植试验表明，原发性肝癌类器官的成瘤潜能、病理学特性和转移能力在体内均可以得到很好地保存。此外，该研究团队还将原发性肝癌的类器官作为生物标记物鉴定和药物筛选模型，用其筛选得到了ERK抑制剂SCH772984作为潜在的原发性肝癌治疗药物。2018年，另有研究团队[32]从肝癌组织穿刺活检材料中成功构建类器官，与2017年的研究相比，该研究扩大了肝癌类器官建立的来源。这是由于手术切除是少数肝癌早期或非肝硬化患者的治疗选择，这些患者通常未接受全身治疗，因此只能在一定程度上反映原发性肝癌的特性，而对于其他进展阶段的肝癌患者，则无法有效地代表。该研究在构建体外类器官的过程中使用了肝癌的液体活检材料，其可取材于接受全身治疗的中晚期肿瘤患者。因此，该研究中活检材料衍生的类器官有助于研究者建立一个反映肝细胞癌全谱的动态生物样本库，可以包括各种临床信息，如治疗反应、耐药性发展和生存预后等数据，从而更好地帮助医生确定个性化治疗方案。

2019年，Erlangga课题组[33]报导了一种利用环化重组cre-lox系统、RNA干扰和定期间隔短回文重复序列相关蛋白9(CRISPR/cas9)与肝脏类器官相结合的技术，建立了一个易于处理的小鼠胆管细胞癌类器官模型，然后将其移植到免疫能力强的同基因小鼠体内。组织学上，肿瘤显示细胞角蛋白19阳性的导管结构，周围有促结缔组织增生的基质即人类乳腺癌的典型特征。该成果加深了人们对于胆管细胞癌类器官的生理病理学的理解。

2016年，Takai等[34]研究证实在多孔海藻酸盐支架中的肝细胞性肝癌细胞可以产生类似于体内腺上皮的许多特征的类器官球状体，例如腺泡的形态发生和EPCAM的顶端表达模式。EPCAM是一种肝干/祖细胞标记物，在具有干细胞性特征的肝细胞癌亚群中高度表达。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路的激活是肝癌球状体形成和腺泡结构维持的必要条件，而Wnt/β-catenin信号通路是肝癌细胞保持细胞干性的重要途径。同时该研究还证实，与传统的二维培养相比，体内培养的EPCAM(+)肝癌细胞对TGFβ诱导的上皮-间充质转化更为敏感，具有更高的致瘤性和转移潜能。此外，EPCAM(+)球体中的肝癌细胞对化疗药物的抵抗力强于2D培养的肝癌细胞。以海藻酸盐为载体的器官型培养系统是一种有前途的、可靠的、简便易行的系统，可用于肝癌关键信号转导途径的鉴定和分子药物靶点的筛选。

2019年，Cao等[35]研究发现可以从小鼠原发性肝肿瘤中建立肿瘤类器官。该研究从129个肝组织/肿瘤中，成功培养出91个细胞株。这些类器官可以在体外长期培养，约20%在免疫缺陷小鼠移植后形成肿瘤，证实了其致瘤性和自我更新特性。来自肿瘤类器官的单个细胞具有高效的类器官启动效率，而来自癌细胞的单个类器官能够启动小鼠的肿瘤，表明肿瘤类器官中的启动细胞增多。此外，这些类器官在一定程度上概括了肝癌患者在表型、癌细胞组成和治疗反应方面的异质性。这些模型系统将为推进肝癌(干细胞)生物学、药物开发和个体化医学方面的研究提供巨大的机会。

2019年，Li等[36]报道了27个可以体外培养的肝癌类器官，同时对包括色瑞替尼等在内的129个肝癌特异性抑制剂或者广靶肿瘤抑制剂进行了药物筛选，证实了不同患者来源的类器官模型对药物的敏感性有差异，发现包括伊沙佐米在内的7个泛肿瘤抑制剂对肝细胞癌具有显著的抑制效果，彰显了肝细胞癌类器官在筛选临床药物方面的巨大潜力。2021年，该课题组[37]同样利用来自肝癌患者的40例肿瘤类器官模型进行了药物筛选工作，发现高三尖杉酯碱具备潜在的有效抑制肝癌类器官的潜能，从“老药新用”的角度为临床肝细胞及胆管细胞癌的治疗提供了新的选项，揭示了肝肿瘤类器官的培养可以对药物进行有效的甄别和筛选。在不久的将来，肝胆肿瘤类器官模型将会向着更大规模，更高的覆盖度以及更加精准的预测药物响应的方向发展，在辅助临床的治疗中发挥更大的作用。

2 基于特异靶点的药物筛选技术

前文讨论的是针对个性化模型开展的药物筛选新技术，而对药物具体作用的机制，则并不完全了解。实际上，肝胆肿瘤患者往往有着同样的特异性突变，这些突变也可以作为药物靶向设计的靶点。针对这些癌症特异的敏感位点，也衍生出了对应的药物筛选技术。

2.1 基于大规模测序数据分析的肿瘤敏感位点预测 随着测序技术的突飞猛进，特别是第二代测序技术的广泛发展及应用，已提出肝细胞癌的分子亚型为增殖、非增殖型，并在多项研究超过1500个样品测序后，确定了肝细胞癌的关键驱动因素，这些关键驱动因素也具有成为药物靶点的巨大潜力[38]。

2.2 基于靶向药物位点的药物筛选技术 肝细胞癌是公认的最耐化疗的肿瘤之一。2007年之前一直缺少系统治疗晚期肿瘤患者的推荐药物，全身化疗药物如多柔比星或奥沙利铂添加5G氟尿嘧啶/亚叶酸钙方案在临床试验中也未显示出生存益处[39-41]。目前，内科精准治疗主要体现在分子靶向药物和免疫治疗，以及目前在各个领域研究较热门的肠道菌群应用。单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂可对潜在靶点进行精确治疗，如高焦点扩增成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子A等[42]分子靶向治疗多靶点酪氨酸激酶抑制剂的系统治疗是一种可以确切治疗各种晚期肿瘤的方法。采用新一代测序技术分析基因组揭示了人类肝细胞癌肿瘤内和肿瘤间的异质性，并提供了有效抵抗肿瘤细胞的多个靶点。索拉非尼是美国食品药品监督管理局批准用于晚期肝细胞癌标准系统治疗的口服多酪氨酸激酶抑制剂[43]，通过选择性抑制血管内皮生长因子受体、血小板源性生长因子受体(PDGFR)阻断肿瘤血管的生成，同时通过阻断RAF/MEK/ERK信号通路抑制肿瘤细胞增殖。欧洲多中心随机SHARP研究(Ⅲ期临床试验)[44]显示，索拉非尼治疗的晚期肝细胞癌患者的中位总生存期从7.9个月延长至10.7个月。FISH分析显示，携带血管内皮生长因子A扩增的肝细胞癌患者对索拉非尼明显敏感。ARAO等[45]研究显示，索拉非尼治疗组的部分患者肿瘤明显缩小。最近，经动脉放疗栓塞vs索拉非尼的Ⅲ期试验未达到主要终点，两者治疗效果对比尚不明确[46]。2017年4月，美国食品药品监督管理局批准瑞戈非尼可在索拉非尼治疗晚期肝细胞癌进展时应用，索拉非尼序贯瑞戈非尼疗法可能对于晚期肝细胞癌患者是一个很好的选择。在多项临床试验中，3种系统性药物在晚期肝细胞癌治疗中均显示出生存益处，包括一线治疗药物索拉非尼和乐伐替尼，以及二线治疗药物瑞戈非尼。2018年，美国临床肿瘤学会消化肿瘤研讨会报道第二、三线治疗的第4种靶向药物——卡博替尼治疗晚期肝细胞癌效果优于安慰剂，患者总生存期也从8个月提高到10.2个月[47]。在不久的将来，基于靶点的药物筛选策略将朝着3个方向发展：(1)寻找肝胆肿瘤的敏感突变位点，为新一代药物的设计提供新的靶标；(2)从多位点多种药物联合治疗的策略解决患者治疗的复杂性问题；(3)进一步揭示“一次突变”背景下，肿瘤可能产生的“二次突变”进而抵抗药物治疗的分子机制，为进一步靶向和治疗肝胆肿瘤提供依据。

3 基于人工智能和大数据整合分析的新型药物筛选技术

随着信息时代下计算机分析能力的突飞猛进，人工智能也越来越多地被应用到了现实生活中，肿瘤药物筛选便是其未来主要发展方向之一。当前，人工智能已经可以借助肿瘤患者全基因组测序数据，结合患者体内外的病理模型和药物敏感性的数据，对患者的治疗提供全方位、多层面的药物治疗指导。

Yao等[48]构建了一个紧密连接的深层神经网络(Densely Connected Deep Neural Networks)，使用13个最常用的肝功能检测指标和人口信息进行肝脏疾病筛查。在一个包含76 914个样本的数据集上进行测试，ROC曲线下面积为0.8919，随机曲线下面积为0.8790，逻辑模型曲线下面积为0.797。结果表明，该模型的性能明显优于传统方法，深层神经网络模型的性能优于DNN(深度神经网络)模型。α胎儿蛋白是目前唯一用于肝癌筛查的血液标志物，但其敏感度和特异度均很低，临床应用受限。对此，Tao等[49]开发了一种基于体细胞拷贝数畸变的机器学习驱动模型，用于HBV感染者早期肝癌的非侵入性检测。经过严格的独立验证，该模型表现出稳健的预测性能，2个验证组的ROC曲线下面积分别为0.920和0.812。由于早期诊断的复杂性，大多数肝癌患者发现时已进入晚期，尤其是肝硬化患者。经过Signal课题组[50]和其他机构的研究，机器学习算法可以提高肝硬化患者分层的准确性，并能准确地识别肝癌高危患者。理想的肝癌预后的关键挑战是尽早发现疾病，以上2种方法的结合，为改善肝癌患者的预后提供了一个巨大的机会。肝癌的预后很大程度上取决于核分级和微血管位置[51]。Cucchetti等[52]开发了一种全新的算法系统，可以根据非侵入性变量预测肿瘤分级和微血管的位置信息。与传统的模型相比，其可以根据术前变量更准确地识别肝癌肿瘤分级和微血管的位置信息，并调整治疗计划和预后的判断。Xu等[53]提出一种结合大规模临床和影像学的计算方法，特别是增强CT的影像学特征，来预测肝癌患者的核分级和微血管的位置和预后，为基础的机器学习模型。该模型在训练和验证集中的ROC曲线下面积为0.909，在测试集中的ROC曲线下面积为0.889。同一类型报告的ROC曲线下面积为0.806[54]和0.918[55]。这些结合的人工智能方法可以加强与患者关于治疗方案的沟通，并指导临床管理人员使用更好的降低复发风险的药物。人工智能辅助临床治疗肿瘤已经开始在手术中应用，而受制于目前临床患者信息及药物数据的不完善和不全面的问题，目前利用人工智能预测药物的策略尚未展开大规模的应用，但随着测序活动的推进和数据库的进一步完善，人工智能在这个基础上可以获得进一步的训练，其预测患者对药物反应的能力将大大提升，将更好地为临床治疗提供依据。相信，基于人工智能和大数据整合分析的新型药物筛选技术在未来必将会大放异彩。

总结当前的肝胆肿瘤药物筛选模型(表1)，可见随着技术的发展，越来越多的新兴技术开始在肝胆肿瘤的药物筛选领域崭露头角，肿瘤的诊断及治疗正在完成从整体性治疗到“个性化”及“精确化”治疗的升级或转变，可以预见的是，以类器官的培养为代表的精准医学技术将会在未来更加精准有效地辅助临床的治疗。

表1 肝胆肿瘤模型与精准药物筛选新技术

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：刘壮负责撰写论文，文献筛选，整理数据和修改论文；高栋负责拟定写作思路，指导撰写论文及并最终定稿。