基于表型性状的羊草遗传多样性评价

侯向阳， 白乌云

(1.山西农业大学草业学院， 山西 晋中 030801； 2.内蒙古师范大学化学与环境科学学院/内蒙古自治区环境化学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010022； 3.中国农业科学院草原研究所， 内蒙古 呼和浩特010010)

羊草(Leymuschinensis)是禾本科赖草属多年生根茎型牧草，是欧亚草原东部半干旱草原优势种之一，是草甸草原的主要建群种和优势种，典型草原和盐生草甸的优势种，荒漠草原的恒有种，也是建植人工草地和治理盐碱化草地的理想草种[1]。羊草在不同生境中广泛分布，生境生态地理条件复杂多样，生态适应性强，具有高遗传多样性的环境基础；但以无性繁殖为主的繁殖格局可能限制羊草遗传多样性。申俊芳等[2]认为，羊草不同基因型间具有类似于物种间的生态位互补效应，能提高羊草种群对干扰的抗性。孔祥军等[3]认为，较高的遗传多样性是羊草抗寒、耐旱、耐盐碱等多重抗逆性的遗传基础。种内遗传多样性是物种以上水平多样性的重要基础，也决定物种进化潜力和抵御干扰的能力。气候暖干化、过度放牧、土壤盐碱化和生境破碎化严重影响我国北方羊草草原区，羊草遗传多样性面临严重威胁[4]。

研究遗传多样性不仅可以揭示物种或居群的进化历史及未来进化方向，而且在保护遗传基因资源、生物资源开发与可持续利用乃至世界粮食安全方面均具有重要意义。羊草适口性好、耐牧，是重要的饲用草和生态草[5]。国内学者主要关注羊草种质资源收集和抗逆性能评价[6-7]、生产性能及栽培技术研究[8-9]，但基于性状的遗传多样性评价研究，特别是根茎克隆繁殖性状的遗传多样性研究仍显不足。基于性状的遗传多样性评价对于合理利用羊草种质资源、综合评价亲本、推动牧草育种及种质创新均具有重要意义，也是探索羊草大尺度长期适应机制研究的基础工作。

本文以不同地理来源66份羊草为试验材料，在同质园栽培条件下，研究羊草质量性状和数量性状的遗传多样性，并绘制了羊草遗传多样性地理分布图，以期为羊草遗传多样性保护和羊草种质资源合理开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

本试验从中国农业科学院草原研究所羊草种质资源圃中选取不同地理来源66份羊草作为试验材料，采样地理范围为35°31′～49°47′ N，102°45′～124°31′ E(图1)，海拔9～2 000 m。羊草采样点年平均气温-2.1～13.3℃，年平均降水量166.6～695.6 mm。不同采样点之间的平均距离为621.02 km，最短距离为29.80 km，最远为1 967.58 km[10]。

本试验在中国农业科学院草原研究所农牧交错区试验示范基地进行(图1)。试验基地位于呼和浩特市土默特左旗沙尔沁乡(40°34′～40°35′ N，111°45′～111°47′ E，海拔1 055 m)，地处大青山与和林格尔丘陵之间的广阔平原地区，属于半干旱大陆性气候，年平均降水量为400 mm左右，年平均气温为5.6℃，≥10℃的积温为2 700℃以上[10]。试验地土壤为淡栗钙土和草甸土，中沙土壤，试验地0～60 cm土层平均指标为：pH8.46，电导率0.101 mS·cm-1，全氮含量1.059%，全钾含量1.85%，铵态氮含量4.138 mg·kg-1，硝态氮含量1.97 mg·kg-1，速效钾含量82.16 mg·kg-1(国家土壤质量呼和浩特观测实验站提供)[11]。

图1 羊草采样点分布图Fig.1 Diagram of sampling sites distribution of L. chinensis

1.2 试验设计与试验方法

土壤条件均匀、平坦的长方形试验地，经秋、春两次机械和人工处理后，分隔成若干个5 m×5 m的生长小区。为消除边缘效应，试验地四边各留5 m空地。2018年4月21日待羊草返青展叶后，用直径为7.5 cm的不锈钢移苗器挖取羊草，每个羊草3个重复，挖取深度为25 cm，挑选长势接近的均有4～5片叶子、须根完整、带一节短根茎、无抽穗迹象的母株[10]，按完全随机设计带土移栽至各小区中心位置，覆土压实，立即浇水，之后每周浇1次水，共浇水4次，确保成活。成活后，不施肥、不灌溉，适时锄杂草，统一管理[10]。

移栽一周后，记录成活母株数，记录第一个根茎子株出土日期，抽穗期记录抽穗母株数，计算母株抽穗率(Heading rate，HR)[12]。2018年8月初，记录叶长(Leaf length，LL)、叶宽(Leaf width，LW)、株高(Plant height，PH)和茎长(Stem length，SL)[13]，并计算叶片大小(LW×LL)和叶长宽比(LL/LW)。2018年9月末，记录母株丛中的分蘖子株数和从母株丛向外扩展的根茎子株数(Number of extravaginal ramets，NER)，并计算母株分蘖倍数(Multiple of genets through tillering，MT)、克隆生长率(Clonal growth rate，CGR)[14]和母株根茎扩展增加倍数(Multiple of genets through rhizome extension，MR)[10]。同时记录根茎扩展方向数(Number of rhizome extension directions，NED)、各方向上的扩展距离、单向最大距离(Maximum one-direction extended distance，MED)，并计算累积扩展距离(Accumulated extended distance，AED)、扩展距离(Extended distance，ED)和扩展面积(Extended area，EA)[1,10]。2018年8月初，无干旱胁迫、日照不强烈天气条件下，记录羊草叶色、叶片软硬(相对触感)、叶片卷曲、叶片生长习性和锈病情况等质量性状[15]。移栽一年时(2019年4月末)，羊草返青展叶后再次记录根茎子株数，计算根茎株跨年增加倍数(Multiple of NER after a dormancy period，MRD)[10]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 质量性状的遗传多样性

羊草5个质量性状的遗传多样性指数平均为0.861，由大至小依次为:锈病发生程度(1.341)>叶片软硬(1.078)>叶片卷曲(1.021)>叶色(0.494)>叶片生长习性(0.369)。试验羊草中灰绿型羊草占绝大多数(占86.3%)，叶片的生长习性多为斜上举型(占87.9%)，但在锈病发生程度、叶片软硬和叶片卷曲方面差异较大，遗传多样性相对较高(表1)。

表1 羊草种质质量性状的遗传多样性(H′)Table 1 Genetic diversity (H′) of qualitative traits of L. chinensis germplasms

2.2 数量性状的遗传多样性

供试66份羊草种质17个数量性状的遗传多样性分析结果见表2。叶长宽比(LL/LW)的遗传多样性最高，为1.518；根茎单向最大扩展距离(MRD)的遗传多样性最低，为0.632。遗传多样性指数由大至小依次为：LL/LW>ED>HR>PH>LW×LL>SL>LL>MED>LW>AED>MT>EA>CGR>NER>MR>MRD。17个数量性状的多样性指数平均值为1.257，13个性状的多样性指数大于平均值，说明所研究的多数性状具有丰富的遗传多样性，羊草遗传基础广、差异大。

表2 羊草种质数量性状的遗传多样性(H′)Table 2 Genetic diversity (H′) of quantitative traits of L. chinensis germplasms

2.3 羊草遗传多样性的地理分布

羊草遗传多样性的地理分布(表3和图2)显示，内蒙古中部地区46°～42°N，114°～118°E范围内羊草遗传多样性最高，其次为50°～46°N，102°～106°E，而50°～46°N，122°～126°E范围内羊草遗传多样性相对最低。

表3 羊草种质遗传多样性(H)的地理分布Table 3 Geographical distribution of genetic diversity (H) of L. chinensis

图2 羊草种质遗传多样性(H)的地理分布Fig.2 Geographical distribution of genetic diversity (H) of L. chinensis germplasms

3 讨论

近30多年来，分子标记技术快速发展，已经被广泛应用于羊草遗传多样性和系统发育研究中[18-19]。分子标记技术虽然在分析羊草遗传多样性方面有显著优势，但往往受种群或基因型数量限制，不能取代基于大量种质材料的形态学分析[20]。本文基于形态学分析进行了羊草遗传多样性评价，对于形态变异较大、遗传变异较小的羊草[21]，先进行表型选择，再进行分子标记与表型选择相结合的遗传多样性评价是必要的。

本研究发现数量性状的遗传多样性高于质量性状，与徐夙侠[21]的研究结果相一致。植物遗传多样性受很多因素影响，如Yuan等[22]研究表明，野生羊草种群的遗传多样性高于移栽种群。本文研究发现即使在栽培条件下，羊草不同性状具有较高的遗传多样性，由此可以推断在野外条件下，羊草遗传多样性可能更高。本文发现，羊草数量性状中株高、叶片大小、扩展距离、叶长、分蘖株数等性状的遗传多样性相对较高，这与Liu等[15]研究结果相一致。一般认为，无性繁殖力强的植物其种群多为遗传单态[23]，然而日渐增多的研究表明，克隆植物种群中存在大量遗传多样性[24-25]，表明我们对克隆植物遗传多样性格局的认识仍很不充分，应加强关键植物种遗传多样性及其成因研究。

羊草遗传多样性地理分布分析发现，羊草遗传多样高的区域海拔相对较高、年均温相对较低、年均降水量相对较少，更重要的是平均温度和平均降水量的变化范围相对较大，可见，水热条件导致的环境异质性可能对羊草遗传多样性具有一定影响。羊草遗传多样性最丰富的区域为锡林郭勒盟中西部地区，该区是我国四大牧区之一的内蒙古牧区的核心区域，长期以草地放牧畜牧业为主；羊草遗传多样性最低的区域为内蒙古扎兰屯市与黑龙江省接壤的草地向森地的过渡带和草地农田过渡带，该区域土地利用变化大、城市化速度较快[26]。全球气候变化、土地利用变化、过度放牧和土壤盐渍化日益加重导致的草地退化使羊草遗传多样性降低[15]。在自然和人为双重干扰下，羊草种质资源遗传多样性面临严重威胁[27]，应重视羊草等草地植物优势种遗传多样性的保护。

4 结论

本文以不同地理来源66份羊草为试验材料，在同质园栽培条件下，基于17个表型和繁殖相关性状，计算Shannon-Wiener多样性指数，分析羊草遗传多样性地理分布，结果标明：羊草不同性状的遗传多样性差异较大，数量性状的遗传多样性高于质量性状；5个质量性状的遗传多样性指数平均为0.861，其中锈病发生程度遗传多样性最高；17个数量性状的多样性指数平均为1.257，其中叶长宽比遗传多样性最高；内蒙古中部地区46°～42° N,114°～118° E是羊草遗传多样性分布中心，也是羊草遗传多样性保护的重点区域。