氮添加对锡林郭勒灌丛草原羊草(Leymus chinensis)化学计量特征的影响

李 丹， 图 雅， 史超逸， 吴倩倩， 张 晓， 时忠杰， 杨晓晖， 刘艳书*

(1. 中国林业科学研究院荒漠化研究所， 北京 100091; 2. 中国林业科学研究院生态保护与修复研究所， 北京 100091；3. 北京林业大学水土保持学院， 北京 100083)

随着社会经济的快速发展、化石燃料燃烧以及氮肥施用量的急剧增加导致大气氮沉降增加，持续氮沉降在提高生产力的同时对生态系统多样性产生威胁，改变碳、氮、磷生物地球化学循环[1]。一般认为适量氮添加可通过改变草原群落物种组成来提高草原群落生产力、恢复退化草原群落的物种多样性[2-3]。不同植物氮利用策略不同，长期氮添加在增加灌木植物群落物种丰富度的同时会降低草本植物群落物种丰富度[4]。近期研究表明，氮添加主要是通过减少禾本科植物的方式降低半干旱区草原群落物种丰富度[5]。目前，国内关于氮沉降对灌丛草原的影响的研究非常薄弱。

近几十年来，在气候变化、过度放牧和土地利用方式改变等影响下，灌丛化在世界范围内干旱、半干旱区草原生态系统中广泛存在[6]。草原灌丛化一方面会促进草原群落净初级生产力、养分循环及土壤有机质积累[7]，另一方面也会改变草原群落的结构和功能，降低草原群落物种丰富度、多样性[8]。尽管目前关于灌丛化对草原群落的影响没有统一结论，灌丛化过程会降低以牛羊放牧为主的草原群落的优质牧草生产力，限制动物的采食，影响草地生态系统多功能[9-10]。因此，过去半个世纪，美国、澳大利亚和非洲的科学家通过刈割、火烧等灌木去除手段控制草原灌丛化，但是恢复的效果是短暂的[9]。在中国也有大面积草原发生了灌丛化，其中内蒙小叶锦鸡儿灌丛化草原最为典型，约占地510万hm2，且有不断扩张的趋势[11-12]。目前，我国对灌丛化草原的研究刚刚起步，少量研究主要集中在灌丛化对草原群落结构的影响上[13-14]，关于氮沉降对灌丛草原植物养分含量及化学计量特征的影响尚不清晰。

化学计量是研究植物多种化学元素质量平衡的一种综合方法，在长期进化过程中，生物体内C∶N∶P比值是相对稳定的[15-16]。Xia和Wan[17]通过对304篇文献456种陆生植物养分含量Meta分析，发现氮添加增加了全球陆地生态系统中豆科植物地上部分N含量但对其地下部分没有显著影响，而非豆科杂类草和禾本科植物地上、地下组织N含量对氮添加的响应没有明显差异。在内蒙古典型草原的研究发现氮添加会增加植物地上部分N含量，降低C∶N[18]；羊草叶片N含量比茎高，氮添加会增加羊草茎叶N含量和N∶P，降低羊草茎叶C∶N[19]。进一步研究发现氮添加会增加典型草原植物叶片N、P含量和叶片N∶P，降低叶片C∶N和C∶P[21-22]。氮添加对典型草原米氏冰草(Agropyroncristatum)、西伯利亚羽茅(Achnatherumsibiricum)、大针茅(Stipagrandis)等草本植物叶片P含量没有影响[23]，而Li等[24]则发现氮添加会降低禾本科植物地上部分P含量。目前的研究主要关注了氮添加对草原群落及植物个体养分状况的影响，但是在草原灌丛化背景下，氮添加对灌丛化草原优势种的影响并未引起足够重视。

内蒙古锡林郭勒草原属于欧亚大陆温性典型草原，近年来小叶锦鸡儿灌丛大面积扩张，草原群落结构和功能发生了改变。小叶锦鸡儿是一种豆科固氮灌木，与草本植物相比具有较强的生存能力，其扩张可能会影响典型草原优势植物的生长[10-11]。羊草作为典型草原主要优势建群种，在维持草原生态系统结构与稳定性方面起着至关重要的作用[25]。因此，我们假设氮添加对灌丛下草本养分特征没有显著影响，但是会促进丛间草本养分积累。为验证我们的假设，本研究以内蒙古锡林郭勒小叶锦鸡儿灌丛草原优势种羊草为研究对象，比较分析氮添加对灌丛下与灌丛间优势物种羊草茎叶C，N，P元素含量的及其化学计量特征的影响，探讨灌丛是否会削弱氮添加对典型草原优势植物养分含量影响，以及灌丛对C∶N∶P化学计量特征的影响分异。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究区位于欧亚大陆典型草原核心区，内蒙古锡林浩特市西北100 km小叶锦鸡儿灌丛草原样地(116°03′～116°07′ E，44°18′～44°25′ N)。研究区属典型温带半干旱大陆性季风气候，冬季寒冷干燥(日均温度-22℃)，夏季温暖湿润(日均温度19℃)。年降雨量为280～350 mm，降雨多集中在7—9月，占全年降水量的60%以上，无霜期90～100 d。地带性土壤类型以暗栗钙土为主，土层厚达1.0 m以上。地带性植被属温性典型草原，植物群落以羊草为优势种，亚优势种有大针茅和糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)，伴生种有胡枝子(Lespedezabicolor)、知母(Anemarrhenaasphodeloides)、狗尾草(Setariaviridis)等。灌木植物以小叶锦鸡儿为主，镶嵌分布在典型草原基质中，形成盖度低于30%的小叶锦鸡儿灌丛草原。

1.2 实验设计及实验处理

本研究中氮添加实验处理采用完全随机区组实验设计，设置6个水平氮添加处理，分别为0 g·m-2·a-1，2.5 g·m-2·a-1，5 g·m-2·a-1，10 g·m-2·a-1，15 g·m-2·a-1和20 g·m-2·a-1(文中标记为CK，N2.5，N5，N10，N15，N20)，每个处理4个重复，共计24个小区，实验小区面积均为50 m×20 m，相邻小区留5 m宽的缓冲带。在每个处理小区内选取4丛灌木，分别在灌丛下与灌丛1 m外选取草本(文中标记为灌丛下和灌丛间)，取样时保证灌丛间草本样品距离其他灌丛大于1 m。2018年6月开始处理氮添加实验，为保证施肥效果，施肥时间选择在生长季雨季来临之前(通常在6月底大雨之前)，将预先称好的尿素一次性均匀地施撒在样方中，对照组不施肥。

图1 研究区位置示意图、实验设计图及灌丛化草原植被景观Fig.1 Location of experiment site,the experimental design and the shrub encroached steppe

1.3 样品采集与元素测定

2019年7—8月，在每个实验小区中随机选取4丛小叶锦鸡儿，分别在灌丛间和灌丛下随机选取20株健康、完整的羊草。将羊草齐地面剪下、装入自封袋中，密封后放入黑暗冰箱保存，带回实验室后按茎、叶分开，在65℃烘箱中烘干至恒重；然后将烘干的植物样品用球磨仪研磨，过筛后用于全碳、氮、磷测定。采用重铬酸钾(外加热法)测定样品C含量，用凯氏定氮法测定样品全N含量，用钼锑抗比色法测定样品全P含量。

1.4 数据分析

本文使用SPSS Statistics 19软件处理分析数据，采用线性混合效应模型(Linear Mixed Model)检验氮添加和灌丛斑块对羊草群落养分含量与化学计量特征的影响，将灌丛作为氮添加的巢式因子。采用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)分别检验氮添加对灌丛间和灌丛下羊草茎叶C，N，P含量及其化学计量的影响；采用Pearson相关分析研究灌丛间和灌丛下羊草茎叶养分含量间的相关关系；采用OriginPro 8软件作图。

为了分析灌丛下和灌丛间羊草茎叶C，N，P养分含量间的变异，计算了对应指标的变异系数(CV，%)。

变异系数=(标准差/算数平均值)×100%

2 结果与分析

2.1 氮添加对灌丛草原羊草茎叶C，N，P含量的影响

氮添加显著影响羊草叶片N，P含量(P<0.05)，而对叶片C含量没有显著影响；灌丛斑块对羊草叶片C，N，P含量影响显著(P<0.05)；氮添加和灌丛斑块的交互作用对羊草叶片C，N，P含量没有显著影响(表1)。氮添加使灌丛下羊草叶片N，P含量比灌丛间羊草叶片N，P含量分别显著增加了19.3%，24.1%，而灌丛下羊草叶片C含量比灌丛间羊草叶片C含量显著降低了4.0%。灌丛间羊草叶片N含量在19.30～22.55 g·kg-1之间，叶片P含量在0.74～0.97 g·kg-1之间，与对照组相比N10，N20处理下灌丛间羊草叶片N含量分别增加了12.4%和14.4%。灌丛下羊草叶片N含量在22.62～26.75 g·kg-1之间，叶片P含量在0.96～1.14 g·kg-1之间，其中N2.5处理下叶片P含量比对照降低了15.8%(图2a，2b，2c)。

表1 氮添加和灌丛斑块对羊草茎叶C，N，P含量及化学计量特征的影响Table 1 Effects of N addition,shrub patch and the interactions on the C,N,P concentration and the stoichiometric characteristics of L. chinensis

图2 氮添加对小叶锦鸡儿灌丛下和灌丛间羊草茎叶C，N，P含量的影响Fig.2 The effect of N addition rates and shrub patch on the C,N,P concentration of the leaves and stems of L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs (mean±SE)注：不同字母表示氮素添加水平间差异显著(P<0.05)，大写字母表示灌丛下，小写字母表示灌丛间。右上角小图中***表示灌丛间及灌丛下差异极显著(P<0.001)，**表示灌丛间及灌丛下差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)，ns表示没有显著差异(P>0.05)，下同Note:Different letters indicate significant differences among N addition treatments at 0.05 level,the capital and lowercase letters indicate under the shrub patches and between the shrubs,respectively;***,** and * indicate significant difference between shrub patch treatments at 0.001,0.01 and 0.05 level,respectively;ns means no significant different in the upper right figure,the same as below

氮添加显著影响羊草茎C，N含量(P<0.05)，而对羊草茎P含量没有显著影响；灌丛斑块显著影响羊草茎N含量(P<0.05)，而对羊草茎C，P含量没有显著影响；氮添加和灌丛斑块的交互作用显著影响羊草茎N含量(P<0.05)，而对羊草茎C，P含量没有显著影响。灌丛间羊草茎N含量在12.45～16.22 g·kg-1，随氮添加增加而增加，与对照相比N15和N20处理约增加了15.4%和30.2%；灌丛间羊草茎P含量在0.84～1.21 g·kg-1之间。灌丛下羊草茎N含量在12.33～14.00 g·kg-1之间，其P含量在0.93～1.11 g·kg-1之间，氮添加降低灌丛下羊草茎C含量，其中N15处理比对照降低了9.7%(图2 d，e，f)。

2.2 氮添加对灌丛草原羊草茎叶化学计量特征的影响

氮添加及灌丛斑块都显著影响羊草叶片C∶N和C∶P(P<0.05)，而对羊草叶片N∶P没有显著影响；氮添加和灌丛斑块的交互作用对羊草叶片N∶P，C∶N和C∶P均没有显著影响。随氮添加水平的增加，灌丛间羊草叶片C∶N呈降低的趋势，而N∶P呈增加的趋势(图3a，c)；灌丛间羊草叶片C∶P在N15处理下达最小值，比对照降低了9.5%(图3b)。随氮添加水平的增加，灌丛下羊草叶片化学计量变化趋势均不显著(图3a，b，c)。

图3 氮添加对灌丛下与灌丛间羊草茎叶C∶N，C∶P，N∶P的影响(平均值±标准误差)Fig.3 The effect of N addition rates on the C∶N,C∶P,N∶P of the leaves and stems of L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs (mean±SE)

氮添加对羊草茎C∶N影响显著(P<0.05)，而对茎N∶P和C∶P没有显著影响；灌丛斑块对羊草茎C∶N，C∶P和N∶P没有显著影响，氮添加处理和灌丛斑块的交互作用对羊草茎C∶N，C∶P，N∶P均没有显著影响。灌丛间及灌丛下羊草茎C∶N随氮添加水平的增加呈现降低趋势，其中N10，N15和N20处理下灌丛间羊草茎C∶N比对照分别降低了16.6%，12.1%，21.2%(图3d)。

2.3 氮添加对灌丛下与灌丛间羊草养分特征相关关系的影响

在灌丛间与灌丛下，羊草茎N含量与叶片N含量及茎叶P呈极显著正相关(P<0.05)，茎P含量与叶片P含量呈极显著正相关(P<0.01)，茎C含量与叶片C含量间无显著相关性。灌丛下叶片N含量与叶片C含量呈显著负相关(P<0.05)，与叶片P含量呈显著正相关(P<0.05)。但是，灌丛间羊草叶片N含量与叶片C和P含量均没有显著相关性(图4)。

图4 小叶锦鸡儿灌丛间(a)及灌丛下(b)羊草茎叶C，N，P含量相关分析Fig.4 Pearson correlation analysis of C,N and P concentration of the leaves and stems of L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs注：各元素含量的单位为g·kg-1，图中绿色表示正相关，红色表示负相关，圆圈面积越大相关性越强；**表示极显著相关(P<0.01)，*表示显著相关(P<0.05)Note:In the figure,green indicates positive correlation,red indicates negative correlation,and the larger the circle area,the stronger the correlation;** and * indicate significant correlation at 0.01 and 0.05 level,respectively

2.4 氮添加对灌丛下和灌丛间羊草养分含量与化学计量特征变异系数的影响

在不同氮添加处理下，灌丛间羊草茎叶C，N，P含量变异系数和化学计量特征变异系数均高于灌丛下相应的变异系数。其中，灌丛间羊草叶片C含量的变异系数为2.95，为灌丛下羊草的2.2倍；灌丛间羊草叶N∶P的变异系数为4.94，为灌丛下羊草的1.6倍；灌丛间羊草茎C∶N和C∶P的变异系数分别达到11.28和15.11，为灌丛下羊草的1.8倍和2.2倍(表2)。

表2 不同氮添加水平下灌丛间及灌丛下羊草C，N，P含量的平均值和变异系数Table 2 Mean and coefficient of variation of the C,N,P concentration under different nitrogen addition rate for L. chinensis under the shrub patches and between the shrubs

3 讨论

3.1 氮添加对小叶锦鸡儿灌丛下、灌丛间羊草养分含量及其化学计量特征的影响

植物从土壤中吸收的氮元素占其总氮的45%～82%，氮添加会增加草原植物叶N含量[26-27]。本研究发现氮添加增加了灌丛间羊草茎叶N含量，降低了灌丛间羊草茎叶C∶N和叶片C∶P，而对灌丛间羊草茎叶N∶P没有显著影响，其中N20处理下植物茎、叶N含量比对照分别增加了30.2%和14.4%。本研究区的相关研究发现羊草叶片N含量随着氮添加梯度的增加而增加[28]，但是氮添加对羊草叶片N∶P没有显著影响[29]。植物茎叶N，P元素均由根系从土壤中吸收而来，本研究所在区域属于氮素限制的半干旱区，适量氮添加可以直接且高效的促进植物对N的吸收。同时，在一定程度上可以促进植物对P的吸收，植物N，P含量的增加使得其N∶P保持在相对稳定的状态。C元素是植物结构物质且与N，P元素的代谢途径不同，主要通过光合作用积累，在植物体内较为稳定，因此氮添加使得植物C∶P和C∶N降低了[30-31]。由于小叶锦鸡儿为固氮植物，其庇护作用使丛下羊草生长受氮素限制较小或是不受氮素限制但是可能受到磷限制，因此氮素添加对灌丛下羊草养分特征及化学计量特征影响不显著，但是叶片P含量可能受氮添加的影响。

目前，关于植物P元素含量及N∶P对氮添加响应的研究尚没有统一结论。以往研究发现氮添加增加了半干旱草原区植物叶片P元素含量[32]，长期氮添加在增加温带草甸草原羊草叶片N∶P和C∶P的同时降低了C∶N[33]，但是De Long等[34]和Zhan等[35]则发现长期氮添加会加剧植物P胁迫，降低植物叶片P含量，增加植物N∶P。导致目前研究结果分异的原因可能是植物吸收的N，P元素均源于生存环境中的土壤溶液，适量氮添加可提高草原群落土壤磷酸酶活性，促进植物对P元素的吸收，但长期氮添加会使土壤酸化，导致植物生长环境养分失衡，限制植物对P素的吸收。另外，植物叶片P含量对氮添加的响应具有滞后效应，可能造成研究结果不一致[36-37]。

3.2 氮添加对小叶锦鸡儿灌丛下、灌丛间羊草C，N，P相关关系的影响

在植物个体水平上，C，N，P的组成及分配是相互联系的，其相互作用共同决定植物生长发育过程[36]。宋彦涛等[38]研究发现松嫩草地80种草本植物的叶片N，P呈显著正相关。Ma等[39]发现高寒草原多年生草本茎叶间N元素，以及茎叶间P元素含量都具有显著相关性，但植物茎叶间C没有显著相关性。本研究发现，灌丛间及灌丛下羊草茎与叶片之间N含量、茎与叶片之间P含量、叶片P含量和茎N含量、以及茎N和P含量间均具有显著正相关相关性。这些结果说明氮素添加与灌丛斑块对植物茎叶间N，P含量的关系影响较弱，短期氮素添加对灌丛草原优势种的化学计量特征影响较小。这可能是因为植物在长期进化过程中，茎叶中N，P含量及比值已经趋于稳态，当外界养分条件发生变化时，短时间内植物会通过一系列生理调节，维持自身各器官中N，P含量相关关系，以维持在不断变化的生长环境中稳定化学计量特征[40]。

此外，我们还发现灌丛下羊草茎叶C含量与茎叶N含量呈显著负相关，而与茎叶P含量没有显著相关性；灌丛间羊草茎、叶片C含量与N，P含量均没有显著相关性。这表明羊草茎叶N，P元素间具有稳定的比例关系，而植物C元素与N，P元素关系相对偏弱，这可能是由于植物C同化过程与N，P养分吸收过程隶属于不同代谢途径所导致的[41-42]，也间接说明短期氮素添加对元素关系影响是比较弱，需要长期的研究才能发现氮添加影响的过程机理。

3.3 灌丛削弱氮添加对羊草养分含量及化学计量特征的影响

不同植物器官具有不同功能，茎部主要起支撑及输导作用，叶片是植物进行光合和呼吸作用等重要生命活动的主要场所，对植物的生长及繁殖过程起决定性作用。本研究发现，灌丛下、灌丛间羊草叶片N含量及N∶P均比茎高。与茎相比，植物叶片具有较高的N，P含量以及N∶P稳态，本研究结果也证明了代谢活跃的器官对N，P元素的需求高[39,43]。在长期进化过程中羊草已形成了较优氮素分配策略，会优先将N元素分配给代谢旺盛的叶片组织，提高植物叶片坚韧程度和光合能力，确保叶片中各种生理代谢活动的有序运行，维持植物健康生长及种族延续。这种养分分配模式是植物在长期进化过程中形成的，不会轻易受外界环境的影响[44-46]。本研究发现灌丛下羊草叶片N，P含量比灌丛间羊草分别增加了19.3%和24.1%，但是灌丛间和灌丛下羊草茎C，N，P含量均没有显著差异，表明灌丛斑块主要影响植物叶片N，P含量，对植物茎C，N，P元素含量没有影响。灌丛下羊草叶片N，P含量均比灌丛间羊草叶片N，P含量高，可能是因为固氮植物小叶锦鸡儿对其丛下草本有庇护作用，即小叶锦鸡儿灌丛化过程会改善灌丛下植物的养分环境，促进草本植物N和P优先供给于活跃的叶片器官[47]。

本研究发现氮添加降低了灌丛间羊草叶片C∶P和C∶N及灌丛下羊草叶片P含量，而对灌丛下羊草茎叶N含量以及茎叶C∶N和C∶P均无显著影响，这可能受小叶锦鸡儿灌丛化影响。小叶锦鸡儿灌丛化过程中，改善了灌丛下羊草的水分和养分条件，并且使氮素不再是灌丛下羊草生长的主要限制因素，但上层灌丛对光照的遮挡作用会对灌丛下羊草造成弱光胁迫，限制植物光合及呼吸作用[48-49]。灌丛下羊草为保证自身的生长发育，需要复制和转录大量遗传物种核酸(P)以增加光竞争能力，这个调节过程会稀释植物叶片中P元素的含量[40]。前人对内蒙古小叶锦鸡儿灌丛化草原的研究发现灌丛斑块田间持水量、土壤有效水量、土壤有机碳和土壤全氮均比灌丛间增加，表明小叶锦鸡儿灌丛在建成过程中，会提高灌丛斑块下土壤水养条件，并进一步影响植物叶片养分含量[50-52]。此外，我们还发现不同水平氮添加处理下，灌丛间羊草C，N，P养分含量的变异系数均高于灌丛下的，进一步证实了灌丛化会削弱氮添加对羊草养分含量及化学计量的影响[53]。

4 结论

氮添加对灌丛下和灌丛间羊草C，N，P含量及其化学计量特征的影响存在分异。氮添加显著增加了灌丛间羊草叶片N含量，20 g·m-2·a-1处理下灌丛间羊草茎N含量，叶N含量比对照分别增加了30.2%，14.4%；氮添加显著降低了灌丛间羊草茎叶C∶P和C∶N，10 g·m-2·a-1处理下灌丛间羊草叶片C∶N比对照降低了13.2%，15 g·m-2·a-1处理下灌丛间羊草C∶P比对照降低了9.5%。但是氮添加对灌丛下羊草茎叶N含量及茎叶化学计量特征没有显著影响。在氮添加与灌丛共同影响下，羊草茎叶C∶N，C∶P和N∶P均没有变化。因此，固氮灌木小叶锦鸡儿的存在降低了氮添加对丛下羊草茎叶养分含量与化学计量特征的影响，随着固氮植物小叶锦鸡儿灌丛的不断扩张，可能会缓解氮素对草原植物的限制。灌丛化可能会削弱氮添加对草本植物的促进作用。