丙泊酚调控HIF-1α表达靶向SIRT1信号通路对胰腺癌细胞增殖凋亡的影响

梁银银 周显飞

[摘要] 目的 探讨丙泊酚对胰腺癌细胞增殖凋亡的影响，进一步分析丙泊酚对胰腺癌细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和沉默信号调节因子1（SIRT1）信号通路的影响。 方法 分别采用5 μg/ml和10 μg/ml的丙泊酚处理胰腺癌Panc-1细胞48 h，设置control组、低剂量组和高劑量组。采用CCK8检测各组细胞的增殖能力，采用Hoechst 33258对各组细胞的凋亡指标进行检测，应用ELISA法测定各组细胞的炎症因子水平，应用qPCR法对SIRT1信号通路mRNA的表达水平进行评判。 结果 与control组相比，低剂量组、高剂量组的增殖能力显著降低（P<0.01），凋亡水平显著升高（P<0.01）;炎症因子IL-6（P<0.01）和IL-1β（P<0.01）水平显著升高，凋亡相关蛋白Fas和FasL的表达显著升高（P<0.01），Bcl-2/Bax显著降低（P<0.01），HIF-1α mRNA的表达水平显著升高（P<0.01），SIRT1 mRNA的表达水平显著降低（P<0.01），HIF-1α蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01），SIRT1蛋白的表达水平显著降低（P<0.01）。 结论 丙泊酚调控HIF-1α表达靶向SIRT1信号通路会促进胰腺癌细胞增殖，加速凋亡。

[关键词] 胰腺癌;丙泊酚;SIRT1信号通路;增殖;凋亡

[中图分类号] R735.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）04-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of propofol on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells， and to further analyze the effect of propofol on hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） and silencing signal regulator 1 （SIRT1） signaling pathway in pancreatic cancer cells. Methods Pancreatic cancer Panc-1 cells were treated with 5 μg/ml and 10 μg/ml propofol for 48 h， respectively. The control group， low-dose group， and high-dose group were set. CCK8 was used to detect the proliferation ability of cells in each group. Hoechst 33258 was used to detect the details of apoptotic indicators of cells in each group. ELISA was used to determine the levels of inflammatory factors in each group， and qPCR was used to evaluate the expression levels of SIRT1 signaling pathway mRNA. Results Compared with the control group， the proliferation ability of the low-dose group and the high-dose group was significantly reduced （P<0.01）; the apoptosis level was significantly increased （P<0.01）; the inflammatory factor IL-6 （P<0.01） and IL-1β （P<0.01） increased significantly; the expression of apoptosis-related proteins Fas and FasL was significantly increased （P<0.01）; Bcl-2/Bax was significantly decreased （P<0.01）; the expression level of HIF-1α mRNA was significantly increased （P<0.01）; the expression level of SIRT1 mRNA was significantly decreased （P<0.01）; the expression levels of HIF-1α protein were significantly increased （P<0.01）; and the expression level of SIRT1 protein was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Propofol regulating HIF-1α expression targeting the SIRT1 signaling pathway can promote the proliferation of pancreatic cancer cells and accelerate apoptosis.

[Key words] Pancreatic cancer; Propofol; SIRT1 signaling pathway; Proliferation; Apoptosis

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是胰腺导管上皮细胞DNA的异常突变导致的恶性肿瘤，是临床上最常见的恶性肿瘤之一[1]。流行病学调查研究发现，胰腺癌的发病率呈逐年增长的趋势，具有恶性化程度高、死亡率高的特点，早期的肿瘤细胞极易扩散至淋巴结及肺、肝脏等器官，5年生存率不超过10%[2]。大多数胰腺癌患者往往因肿瘤扩散和血管浸润而丧失手术条件，只能采用放疗、化疗等手段进行辅助治疗，但效果较差，目前手术切除仍是胰腺癌患者最有效的治疗手段[3]。临床数据表明，围术期麻醉对于肿瘤细胞的炎症反应、免疫应激反应产生较大影响，会影响肿瘤细胞的增殖和凋亡[4-5]。丙泊酚是临床上常用的全身麻醉药物之一，常用于多种途径的镇静和麻醉过程，具有起效快、可控性好和代谢快的优点[6]。近年来，研究者发现，丙泊酚与多种肿瘤的生物学效应及预后密切相关，其通过影响肿瘤细胞内自由基及炎症损伤过程而调控肿瘤细胞的增殖[7]。Chen等[8]研究发现，氟烷可影响乳腺癌细胞的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，促进术后肿瘤细胞出现自发性肺转移。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是组蛋白乙酰化酶，是肿瘤治疗和诊断的靶点，激活SIRT1信号通路可抑制细胞的凋亡、炎症和氧化反应[9]。目前有关丙泊酚对SIRT1信号通路及胰腺癌细胞的调控作用研究尚少，本课题拟通过体外实验研究丙泊酚对SIRT1信号通路、胰腺癌细胞的常规调控水平，为胰腺癌患者手术治疗的麻醉剂的选择提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

胰腺癌Panc-1细胞购自中国科学院上海细胞库;DMEM培养基（Gibco公司）;胰蛋白酶（Sigma公司）;胎牛血清（Gibco公司）;丙泊酚（Sigma公司）;CCK8试剂盒（Sigma公司）;Hoechst细胞33258试剂盒（碧云天生物科技有限公司）;白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（博士德生物科技有限公司）;白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（博士德生物科技有限公司）;BCA蛋白定量试剂盒（美国Invitrogen公司）;PVDF膜（Millipore公司）;Fas、FasL、Bax、Bcl-2、HIF-1α、SIRT1和GAPDH单克隆抗体（Abcam公司）;二抗（上海银海圣生物科技有限公司）;ELC发光液（Thermo Fisher Scientifice公司）;RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）;逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）;应用Life Technologies 公司生产的Taq Man Micro RNA Reverse Transcription Kit试剂盒;BIO-RAD公司生产的酶标仪;COSTAR公司生产的96孔板;COSTAR公司生产的6孔板;赛默飞科技有限公司生产的细胞培养箱;德国Sartorious公司生产的电子天平，其他相关仪器和试剂均已在相关部分说明。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理  复苏细胞后接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养，细胞长至80%即可传代。采用胰蛋白酶消化细胞，设置5×104个/孔的细胞密度，将其接种于96孔板中，并向其加入适量的10%胎牛血清放入DMEM培养基中培养。设置control组、低剂量组和高剂量组，低剂量组细胞加入5 μg/ml的丙泊酚处理细胞，高剂量组细胞加入10 μg/ml的丙泊酚处理细胞，Control组加入等量的血清进行空白处理，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中继续培养，处理48 h后检测各组细胞的生物学特性。

1.2.2 CCK8检测细胞的增殖能力  Control组、低剂量组和高剂量组细胞经不同浓度的丙泊酚处理48 h，采用CCK8检测各组细胞的增殖能力，每孔加入10 μl的CCK8溶液，继续置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养4 h，酶标仪参数：450 nm，检测各组细胞的OD值，确定细胞的增殖能力。

1.2.3 Hoechst 33258检测细胞的凋亡水平  采用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为1×106个/孔，并与6孔板连接，向其加入适量的含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中，Control组、低剂量组和高剂量组细胞经不同浓度的丙泊酚处理48 h，采用Hoechst 33258检测各组细胞的凋亡水平，弃去上清液，加入新鲜配置的4%多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗3次，每孔加入50 μl的Hoechest 33258染色剂，置于室温下避光孵育10 min。用熒光显微镜拍照，记录各组细胞的状态，计算各组细胞的凋亡水平。正常的细胞为暗蓝色，细胞核中出现高亮的蓝色则表明细胞出现凋亡，计为凋亡细胞。

1.2.4 ELISA法检测细胞中炎症因子的水平  采用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为1×106个/孔接种于6孔板中，加入适量的含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，Control组、低剂量组和高剂量组细胞经不同浓度的丙泊酚处理48 h，采用ELISA法对患者各组细胞中IL-6、炎症因子、IL-1β指标水平实施检测，并根据试剂盒说明书进行操作，酶标仪参数：450 nm，检测细胞OD值，测定炎症因子IL-1β、IL-6水平。

1.2.5 Western blot检测蛋白的表达水平  采用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为1×106个/孔接种于6孔板中，向其加入适量的含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中，Control组、低剂量组和高剂量组细胞经不同浓度的丙泊酚处理48 h，弃去上清液，加入适量的RIPA裂解液裂解细胞，离心机参数：4℃、12 000 rpm，离心10 min后取上层清液，应用BCA蛋白定量试剂盒对各组细胞的蛋白浓度进行检测，制备等浓度的上样缓冲体系，95℃水浴锅煮沸灭活，采用12%的SDS聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶进行电泳，当其进行转膜后可实施蛋白转移，将其置于PVDF膜上，并新鲜配置5%脱脂奶粉，将其封闭PVDF膜中2 h，根据目的条带的分子量大小切下目的条带，分别于4℃条件下孵育Fas、FasL、Bax、Bcl-2、HIF-1α、SIRT1和GAPDH（抗体均采用1∶1000稀释）过夜，用TBST洗涤蛋白条带3次，于室温条件下孵育辣根过氧化物酶共轭的二抗（采用1∶5000稀释）1 h，用TBST洗涤蛋白条带3次，暗室内加入ECL发光液（A液与B液按1∶1混匀）后进行显影和定影，再将条带扫描后利用Image J软件进行灰度值分析。

1.2.6 qPCR检测相关mRNA的表达水平  采用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为1×106个/孔，并与6孔板连接，向其加入适量的含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中，Control组、低剂量组和高剂量组细胞经不同浓度的丙泊酚处理48 h，弃去上清液，加入适量的Trizol，采用RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，测定总RNA浓度和纯度。按照逆转录试剂盒的操作，配置25 μl的反应体系，逆转录后获得cDNA。配置qPCR反应体系，反应条件为：94℃变性5 min，95℃ 30 s，63℃ 50 s，72℃ 60 s，共35个循环，以GAPDH为内参，测定各组细胞中HIF-1α和SIRT1 mRNA的相对表达水平。引物由英潍捷基生物科技有限公司合成，序列见表1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步采用Bonferroni校正的t检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。P<0.05为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1丙泊酚对胰腺癌细胞增殖的影响

采用CCK8检测丙泊酚对胰腺癌细胞增殖能力的影响，结果显示低剂量组和高剂量组细胞的增殖能力明显低于control组，高剂量组细胞的增殖能力明显低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。

2.2 丙泊酚对胰腺癌细胞凋亡的影响

采用Hoechst 33258检测丙泊酚对胰腺癌细胞凋亡水平的影响，结果显示高剂量组、低剂量组细胞的凋亡水平明显高于control组，高剂量组细胞的凋亡水平明显高于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图2。

2.3丙泊酚对胰腺癌细胞炎症因子水平的影响

采用ELISA试剂盒检测丙泊酚对胰腺癌细胞炎症因子水平的影响，结果显示低剂量组、高剂量组细胞IL-6与IL-1β水平均明显高于control组，高剂量组细胞IL-6与IL-1β水平均明显高于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

2.4 丙泊酚对胰腺癌细胞凋亡蛋白表达的影响

采用Western blot检测丙泊酚对胰腺癌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响，结果显示低剂量组、高剂量组细胞Fas与FasL的表达水平均明显高于control组，Bcl-2/Bax明显低于control组，差异有统计学意义（P<0.01）;高剂量组细胞Fas与FasL的表达水平均明显高于低剂量组，Bcl-2/Bax明显低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3。

2.5 丙泊酚对胰腺癌细胞SIRT1信号通路的影响

分别采用qPCR和Western blot检测丙泊酚对胰腺癌细胞SIRT1信号通路的影响，结果显示两种检测方法结果一致。低剂量组、高剂量组细胞HIF-1α mRNA与蛋白的表达水平均明显高于control组，SIRT1 mRNA与蛋白的表达水平均明显低于control组，差异有统计学意义（P<0.01）;高剂量组细胞HIF-1α mRNA与蛋白的表达水平均明显高于低剂量组，SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平均显著低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图4～5。

3讨论

胰腺癌是恶性化程度很高的肿瘤之一，具有侵袭性强、进展快的特点，对多种化疗药物不敏感，故手术切除是目前早期胰腺癌患者最常用的治疗手段[10]。胰腺癌围术期会受到多种因素影响，产生免疫、内分泌系统功能异常，导致肿瘤扩散，对患者的预后产生影响。研究表明，不同麻醉药物会对肿瘤细胞的恶性潜在性能产生影响。丙泊酚属于临床常见的静脉麻醉药。相关研究发现，丙泊酚能够实现胰腺癌细胞的恶性潜能抑制。程序性死亡因子、程序性死亡配体属于一对免疫共刺激分子，二者均参与肿瘤的发生及发展。

臨床研究表明，胰腺癌组织的高表达与淋巴结转移情况存在一定联系，影响患者的预后。相关实验证明，胰腺癌细胞的高表达能够有效实现细胞增殖，PD-Ll低表达能够有效抑制胰腺癌种植瘤的生长。

Carmicheal等[10]研究发现，麻醉剂可参与肿瘤细胞的病理和生理过程，影响血管生成，介导细胞的增殖和凋亡过程。本研究采用体外实验研究丙泊酚对胰腺癌细胞Panc-1增殖和凋亡的影响，结果发现，5 μg/ml和10 μg/ml的丙泊酚处理胰腺癌Panc-1细胞48 h可导致细胞的增殖能力显著降低，凋亡水平显著增加，且具有剂量依赖性，高浓度的丙泊酚更能有效抑制胰腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。本研究进一步发现，丙泊酚可显著增加胰腺癌细胞中凋亡蛋白Fas与FasL的表达，降低Bcl-2/Bax的表达。FasL为Fas的配体，均属于肿瘤坏死因子家族的细胞表面受体，细胞内Fas与FasL的表达水平增加，其相互作用可导致细胞凋亡;Bcl-2是抗凋亡家族成员，可通过抑制细胞内线粒体凋亡过程而降低细胞的凋亡，临床上常采用Bcl-2/Bax评价肿瘤的凋亡水平[11-12]。激活肿瘤细胞凋亡途径可诱导细胞释放大量的炎症因子，严重的炎症反应可进一步激活细胞自噬过程，进一步损伤细胞[13]。本研究结果显示，丙泊酚可显著增加胰腺癌细胞内炎症因子IL-6与IL-1β的水平。

低氧诱导处理可导致缺氧诱导因子-1广泛存在于人体和哺乳动物体内，是参与细胞内氧代谢调控的重要细胞调节因子，由120 kD的α亚基和91～94 kD的β亚基组成的异源二聚体[14-20]。本研究结果表明，丙泊酚可抑制胰腺癌细胞SIRT信号通路，显著降低胰腺癌细胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表达。

综上所述，丙泊酚通过激活胰腺癌细胞中HIF-1α的表达，进而靶向抑制SIRT1信号通路，增加细胞内炎症因子释放，增强细胞内凋亡蛋白的表达，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，该研究结果为临床上胰腺癌患者手术过程中选择合适的麻醉剂提供理论依据。

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（收稿日期：2021-01-20）