参术宁心方对心房颤动大鼠炎症反应拮抗作用的实验研究

刘 攀，方才敬，戴小华

心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床上最常见的心律失常，是发生心肌梗死、肺栓塞、脑梗死等危急重症的危险因素[1]。引起AF的风险因素众多，研究发现的确定因素包括高血压、超重、饮酒、吸烟、糖尿病等[2]；除此之外，心房增大、冠心病、心肌梗死等心脏病变可诱发AF，且心脏发生器质性改变使AF得以维持[3]。研究表明，中医药在“整体观”和“治未病”的理论指下，通过多靶点作用，治疗心血管原发病的同时可预防AF及其并发症的发生[4-5]。除此之外，当AF发生时，心房细胞处于缺血缺氧状态下，炎症反应加重心肌纤维化[6]。因此，对于AF，可从拮抗炎症反应角度进行预防和治疗，尤其是射频消融术后，预防AF的再发成为中医药防治本病的研究热点。安徽中医药大学第一附属医院心内科在防治AF方面有丰富的临床经验，善用“调脾护心、安神定悸”法，注重调护脾胃以求“母病救子”“实子补母”和“未病先防”。前期数据挖掘已总结出临床核心处方参术宁心方，网络药理学是基于大数据对药物成分靶点、疾病靶点、核心差异基因分子功能、信号通路进行数据化分析，可发现药物作用于疾病时的有效成分、具体靶点、分子通路，构建药物-疾病靶点网络[7]，为临床研究药物干预疾病提供参考。本研究探讨参术宁心方对AF大鼠炎症反应的拮抗作用和网络药理学机制，为中医药临床防治AF提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠59只，购自安徽医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证：SCXK(皖)2017-001)，其中预实验9只，经预实验验证体重选择250～300 g尾静脉注射最适宜，雄性，12周龄；每笼2～4只大鼠饲养，为排除环境影响，所有大鼠实验前饲养1周，全过程标准化饲养，饮食充足，垫料清洁，温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%。

1.2 药物

1.2.1 中药 参术宁心方：沙参10 g，甘松8 g，丹参10 g，人参6 g，陈皮15 g，白术20 g，党参10 g，酸枣仁20 g等，颗粒剂由安徽中医药大学第一附属医院提供，均由广州一方药业生产，开水冲解，浓度为1 g/mL，给药剂量经人鼠换算公式[大鼠剂量=成人剂量(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g]计算为24.23 g/(kg·d)。

1.2.2 西药 胺碘酮由杭州赛诺菲圣德拉堡民生药业生产，温水溶解，以临床成人最大维持剂量1.5倍溶解，浓度为10.8 mg/mL，给药剂量经人鼠换算公式计算为54 mg/(kg·d)；麻醉剂(乙氟烷-大小鼠麻醉机用乙氟烷，深圳市瑞沃德生命科技有限公司生产)：维持浓度为2.0%～2.5%，流量为500～700 mL/min麻醉。AF大鼠模型复制：新配乙酰胆碱-氯化钙溶液(Ach-CaCl2)按Ach 99 μg/mL+CaCl210 mg/mL(Ach的CAS号：60-31-1，购自上海笛柏生物科技有限公司；CaCl2的生产批号：1807142，购自西陇科学股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 网络药理数据库研究 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索参术宁心方各中药成分[以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为限制条件]及其作用靶点；使用Cytoscape 3.8.0制作中药成分-靶点图，可视化中药成分-靶点之间的具体联系；使用Gene Cards数据库搜索AF相关靶点，得到疾病靶点，并以Score≥5.0为限制条件；将中药靶点、疾病靶点取交集，得到交集基因；使用STRING数据库，以置信度≥0.4为限制条件，对交集基因进行分析，得到蛋白质-蛋白质互作(PPI)图，并保存为TSV格式，使用Cytoscape 3.8.0对PPI进行可视化处理；使用DAVID数据库对交集基因进行Gene Symbol转化，转换为ENSG格式，使用Omic Share平台对交集进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。

1.3.2 预实验 参考文献[8]进行阵发性AF大鼠模型复制，探索适宜尾静脉注射的大鼠体重，取200 g、250 g、300 g、330 g大鼠各3只，特制大鼠固定→尾部40 ℃温水加热→酒精消毒(同时扩张尾静脉)→1 mL注射器平刺进针→回抽(以注射器内进血为准)→注射Ach-CaCl2溶液0.1 mL/100 g，每日1次，连续7 d，最后一次尾静脉注射前麻醉大鼠，测大鼠标准二导联心电图，确认尾静脉穿刺准确后注射药液，同时标记注射时间点，以心电图P波消失，代之以连续的f波，心律绝对不齐为造模成功。经验证大鼠体重在250～300 g尾静脉注射最适宜，基于数据挖掘的参术宁心方干预Ach-CaCl2诱导AF大鼠的实验研究造模成功率高，造模方案可行。预实验使用后的大鼠不参加正式实验。

1.3.3 动物造模及分组 将50只雄性SD大鼠随机分为预防组、西药组、中药组、模型组和正常组，各10只；尾静脉注射Ach-CaCl2溶液0.1 mL/(100 g·d)连续7 d造模。中药组按预实验方案进行AF模型大鼠复制，参术宁心方按剂量24.23 g/(kg·d)灌胃，第8天起，每日灌胃后1 h，尾静脉注射Ach-CaCl2溶液，连续14 d；西药组给予胺碘酮54 mg/(kg·d)灌胃；模型组灌胃生理盐水2 mL/(kg·d)；预防组先给予参术宁心方24.23 g/(kg·d)灌胃，连续14 d，第15天起，每日灌胃生理盐水2 mL/(kg·d)，1 h后尾静脉注射Ach-CaCl2溶液，至第21天，保证药物干预时间和尾静脉注射造模药物时间相同；正常组灌胃等量生理盐水，尾静脉注射等量生理盐水。

1.3.4 实验前后标准Ⅱ导联心电图的收集 ①实验前各组大鼠理想状态下均麻醉剂采用维持浓度为2.0%～2.5%、流量为500～700 mL/min麻醉，连接生物信号采集系统描计标准Ⅱ导联心电图，待心电图描计清晰后，持续记录5 min，排除心律失常大鼠。②确认AF模型是否成功：尾静脉注射Ach-CaCl2溶液7 d后，在大鼠麻醉状态下连接生物信号采集系统，描计尾静脉注射造模药液后标准Ⅱ导联心电图，保留造模成功大鼠。③最后1次灌胃后1 h，采用同样方法收集心电图，电脑标记注射时间，整理数据，以A点为起始点，B点为大鼠出现典型AF心电图时间点，C点为大鼠AF消失时间点，利用计算机计算TAB(A点至B点的时间)、TBC(B点至C点的时间)，为大鼠AF诱发时间，TBC为大鼠AF持续时间。

1.3.5 血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)水平检测 试验结束后，大鼠禁食水10 h，麻醉状态下，腹主动脉取血，每只取血量约4 mL，0 ℃冰块中静置15 min，离心，取上层血清，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.3.6 心肌Masson染色 腹主动脉取血后，摘取心脏标本，置于4%多聚甲醛固定(固定时间24 h，于4 ℃恒温冰箱内)，石蜡包埋。技术路线：石蜡切片脱蜡至水→重铬酸钾染色→铁苏木素染色→丽春红酸性品红染色→磷钼酸染色→苯胺蓝染色→分化→透明封片显微镜镜检，图像采集分析。

2 结 果

2.1 大鼠状态 各组大鼠活动灵敏，呼吸均匀，皮毛有光泽。中药组和西药组大鼠尾静脉注射后呼吸、心率加快，目光呆滞，眼睛充血，5～7 min恢复，呈乏力、喜倦卧，西药组轻度食欲减退，中药组无明显食欲减退；预防组大鼠尾静脉注射后呼吸、心率加快，动作迟缓，眼睛充血，4～5 min恢复，呈乏力状态，饮食正常；模型组尾静脉注射后腹式呼吸加快，心率加快，眼睛充血，动作迟钝，13～19 min恢复，呈乏力、喜倦卧，食欲减退，体重减轻；正常组惊吓后心率、呼吸加快，可以很快恢复，无明显其他改变。各组大鼠存活及死亡情况详见表1。

表1 各组大鼠实际存活及死亡情况 单位：只

2.2 AF大鼠模型的制备 实验第7天，除正常组及死亡大鼠外的其余大鼠均可诱发AF。各组大鼠在经历不同的心律失常后出现典型的AF心电图(标准Ⅱ导联P波消失，代之以连续的f波，心律绝对不齐)，最后恢复为窦性心律，实验各项数据的收集严格以标准的AF心电图为准。详见图1。

图1 大鼠心电图变化(A为实验前大鼠正常心电图；B为由窦性心律转为AF心律；C为尾静脉注射造模药液后大鼠出现AF心律；D为由AF心律转为窦性心律)

2.3 各组AF诱发时间和持续时间比较 与模型组相比，预防组、中药组、西药组大鼠AF诱发时间均延长(P<0.05)，其中预防组AF诱发时间最长[(3.26±0.46)s]，说明提早灌胃中药具有预防AF的作用；西药组AF诱发时间较中药组延长(P<0.05)，提示胺碘酮的防治效果较好。预防组、中药组、西药组AF持续时间较模型组明显缩短(P<0.05)，提示胺碘酮和参术宁心方可缩短AF持续时间；中药组、西药组AF持续时间与预防组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示参术宁心方在发生AF前后干预可对大鼠AF持续时间产生不同效果；中药组与西药组AF持续时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠AF诱发时间和持续时间比较(±s) 单位：s

2.4 各组血清TNF-α、IL-1、IL-6水平比较 预防组、中药组、西药组血清TNF-α、IL-1、IL-6水平均低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；中药组、西药组TNF-α、IL-1、IL-6水平与预防组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示参术宁心方在发生AF前后干预可对大鼠AF炎症反应产生不同拮抗作用；中药组TNF-α、IL-1、IL-6水平均低于西药组(P<0.05)。详见表3。

表3 各组血清TNF-α、IL-1、IL-6水平比较(±s) 单位：pg/mL

2.5 心肌(心房)Masson染色 在Masson染色中，胶原纤维被苯胺蓝染色呈现蓝色，肌纤维被酸性品红和丽春红染色呈红色，红细胞呈现橘红色，通过这种染色方法可定性、定量显示组织或者炎症的修复与纤维化程度，蓝色区域在视野内占比越高，则心肌间新生胶原纤维越多，心房纤维化就越严重，反之则轻。所有镜下图片取相同放大倍数。正常组心肌细胞排列整齐，形状椭圆，外基质中少许正常点状蓝色区域，为正常胶原结构；模型组视野内细胞排列紊乱、间隙增大，形状异怪，蓝色区域密集且染色深，呈片状分布，心肌纤维化程度最高；预防组细胞部分异形，排列尚整齐，除正常细胞结果外，蓝色区域较正常组多，点状分布，离散存在，新生心肌纤维化成分较模型组少，镜下病理改变情况好于中药组，说明预防组能更好地预防心肌纤维化；西药组细胞排列大部分正常，形状可，整体橘红色，蓝色区域点状分布，即正常组织多，纤维化程度较模型组低；中药组少部分片状区域紊乱，组织点片状坏死，颜色深浅不齐，心肌间质水肿，视野整体暗红色，红色小点块区域较多，蓝色区域呈条状散在分布，说明胶原纤维和肌纤维较正常组多，但少于模型组。详见图2。

图2 各组大鼠AF心肌纤维化情况(×400，50 μm)

2.6 网络药理学机制研究 通过TCMSP搜索参术宁心方各中药成分及其作用靶点并进行PPI分析：成分-靶点分析可见参术宁心方药物作用靶点集中在炎症相关基因位点，其中一氧化氮合酶3(NOS3)、IL-6、IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、内皮素1(EDN1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)靶点与细胞能量代谢和炎症反应密切相关，提示本方可调控炎症反应，详见图3、图4；KEGG分析显示：药物靶点基因密集在晚期糖基化产物(AGE)-晚期糖基化产物受体(RAGE)、MAPK、白介素(IL)、TNF信号通路，验证了参术宁心方拮抗AF炎症反应的药理学效应，详见图5、图6。

图4 PPI互作和网络拓扑分析(A为PPI互作图；B为网络拓扑分析图。节点代表靶点，连线代表相互作用，颜色及大小代表频次)

图5 KEGG富集分析(图形节点代表通路，长短和大小代表靶点数目，颜色代表P值)

图6 主要信号通路关系

3 讨 论

AF为临床中最常见的心律失常，是脑卒中和心血管危急重症的危险因素[9]，国家大力增建“房颤中心”以救治AF病人，AF的防治成为研究的热点。目前，对于AF病人，及时的药物抗凝、减慢心率可减少AF的并发症[10]，特别是射频消融术，能有效阻断AF发生异常心电活动[11]，但是AF的复发性和具体机制尚不明确[12]，临床对本病的防治面临决策难题。其中，心房的快速起搏和心室重构使心房细胞处于缺血缺氧环境，心脏组织发生炎症反应，心肌纤维化进一步加重，互为因果。

中医药防治本病历史悠久，疗效确切。《本草纲目》中“参类养心”启发近现代医者如何防治本病，其中经典治法“调脾护心、安神定悸”临床疗效显著。在《难经》中有： “脉来上大下兑，啄啄连属”如是描述，近现代医家根据其心慌、脉搏短绌等临床表现，可将其归属于心悸范畴。本病病位在心，和脾胃相关，心与脾胃乃“母子”关系，在五行、经络和脏腑功能等方面由此及彼。基本病机属本虚标实，本虚为心之气血阴阳亏虚，标实相连于痰饮、瘀血、火热、寒邪等相关[13]。大量研究在辨证论治的基础上，治法不相同，但都趋于相同病因病机为大纲，其中，调脾护心、养心定悸法疗效确切[14]。参术宁心方立意源自孙思邈《备急千金要方》：“心劳病者，补脾气以益之，脾旺则感于心矣”，以益气健脾、养心定悸为基本治则治法。参术宁心方以党参、人参、丹参、沙参和白术为君药，意在“参类补气、益气、养心”和白术补气健脾，注重调脾护心和“母病救子”；酸枣仁养心安神，甘松理气止痛，与君药形成补气不忘理气之功， 两药相伍既理气，又养心血，共为臣药；远志宁心安神、祛痰开窍，陈皮理气健脾、燥湿化痰，竹茹清热化痰，三药合用佐助君药养心、祛实邪为佐药；蒲公英轻清而性甘，升举而调和诸药为使药。

从现代药理研究来看，党参可抑制过度激活的钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶A，抑制L型钙电流、Na+-Ca2+交换体电流等内向电流重构，从而抑制异常触发活动的发生，进而抗心律失常[15]。人参、丹参、沙参含人参皂苷，具有抗心肌缝隙连接重塑、抑制 Ca2+-K+离子通道等抗心律失常的作用[16]。白术内酯可抑制炎性因子 TNF-α、白介素-1β(IL-1β)和 IL-6 的表达，从而发挥抗炎活性，并可抑制 MAPK和核转录因子(NF-κB)的活化，从而减少AF的发生[17]。酸枣仁可对心肌细胞电生理产生影响，降低心律失常发生率，并可减少 5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)含量，从而起到抗抑郁、镇静的作用[18]。甘松新酮可影响环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)传导通路，明显抑制大鼠心肌细胞的快速搏动，可对抗快速性心律失常[19]。陈皮及其成分可较强地改善心脑血管疾病的作用，如心脑保护、抗动脉硬化、抗血栓等，其中橙皮苷、柚皮苷具有很强的抗炎及抗氧化作用[20]。蒲公英可阻滞血小板聚集，并且蒲公英多酚在一定浓度范围内对自由基有较高的清除率，有较强抗氧化能力，从而降低AF发生率[21]。竹茹多糖可作为免疫促进剂，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等作用[22]。远志寡糖酯可通过调节氨基末端激酶(JNK)、MAPK和NF-κB信号通路，抑制巨噬细胞中产生一氧化氮、前列环素E2、环氧化酶-2及促炎因子TNF-α和白介素1β，可发挥抗炎作用，继而减少AF发生[23]。网络药理方法进行成分-靶点分析可见参术宁心方药物作用靶点集中在炎症相关基因位点，其中NOS3、IL-6、IL-1、TNF、VEGFA、EDN1、MAPK靶点与细胞能量代谢和炎症反应密切相关；KEGG分析结果显示，药物靶点基因密集在AGE-RAGE、MAPK、IL、TNF信号通路，验证了参术宁心方拮抗AF炎症反应的药理学效应；从实验结果来看，参术宁心方能延长大鼠AF诱发时间(P<0.05)，缩短AF持续时间(P<0.05)，降低AF大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平(P<0.05)，减轻心肌纤维化程度。

综上所述，参术宁心方内含有人参皂苷、白术内酯、甘松新酮、竹茹多糖、远志寡糖酯等多种物质，有效延长大鼠阵发性AF诱发时间，缩短AF持续时间，通过拮抗炎症作用减轻心肌组织纤维化，与AGE-RAGE、MAPK、IL、TNF信号通路相关。