叶面喷施褪黑素对NaHCO3胁迫下番茄幼苗光合特性的影响

蒋希瑶,牛 宁,崔洪鑫,魏少伟,熊 航,刘慧英,刁 明

(石河子大学农学院，特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832003)

加工番茄产业是新疆特色优势产业。目前新疆已成为继意大利、美国之后的世界第三大番茄酱产区，是亚洲最大的番茄生产和加工基地[1]。但在新疆加工番茄的种植中，受“三山夹二盆”独特的自然地理环境和气候条件影响，新疆成为盐碱地重发区，土地盐渍化和次生盐渍化严重制约了加工番茄的生产，其中碱性盐的高pH值对番茄造成的伤害远比中性盐胁迫更为严重[1-2]。因此，研究加工番茄耐碱机制、提高番茄耐碱能力，对新疆加工番茄产业具有重要意义。

褪黑素(Melatonin，MT)是一种存在于动植物体内的多效性分子, 在植物细胞中主要作为抗氧化剂，对细胞中的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)以及其他自由基和有害氧化分子具有重要的控制作用，可缓解非生物胁迫对植物的伤害[3]。研究表明，MT预处理可激发保护酶的活性，有效抑制高温下黄瓜幼苗ROS的产生，从而显著缓解高温胁迫对黄瓜幼苗光合器官的伤害，提高黄瓜光合能力[4-5]。MT也能有效应对水分亏缺对番茄幼苗的胁迫，缓解其受到的氧化损伤，提高番茄的干旱适应性，并促进番茄生长，最终提高果实的品质[6]。KAMIAB F[7]发现使用100 μmol·L-1MT对150 mmol·L-1盐胁迫下阿月浑子的保护作用最为显著，MT可通过增强抗氧化能力、渗透调节能力、养分吸收和多胺生物合成而达到减轻盐胁迫目的。LIU等[8]发现根施0.5 μmol·L-1的MT可有效缓解NaHCO3(75 mmol·L-1)胁迫对番茄生长的抑制作用。现有研究对于叶面喷施MT对NaHCO3胁迫下加工番茄的调控作用机理尚少见报道，而MT的施用效果及调控作用又因施用方法和施用浓度的不同而存在差异。因此本试验以加工番茄品种‘里格尔87-5’为材料，对NaHCO3(50 mmol·L-1)胁迫下的番茄幼苗叶面喷施不同浓度的MT，通过测量幼苗光合色素含量、光合气体交换参数以及快速叶绿素荧光动力学特性，探讨外源喷施不同浓度MT对NaHCO3胁迫下加工番茄的影响效应，并筛选出提高番茄耐碱能力的适宜MT浓度。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为加工番茄品种‘里格尔87-5’(石河子蔬菜研究所提供)。试验所用褪黑素(MT)购于上海源叶公司。

1.2 试验设计

1.2.1 番茄幼苗的培育 试验于2020年9―11月在新疆石河子大学农学院试验站温室内进行。选取健康饱满的种子播于盛装有泥炭∶蛭石=2∶1(V/V)基质的72孔穴盘中。待幼苗长至三叶一心期时，选取长势基本一致的幼苗移栽于装有12 L 50% Hogland营养液的水桶中预培养7 d后，再移栽于盛装有100% Hogland营养液的水桶中培养并进行处理。

1.2.2 胁迫处理 试验共设置9个处理，分别为：(1)CK：营养液+叶面喷施蒸馏水；(2)MT0：NaHCO3胁迫处理+叶面喷施蒸馏水；(3)MT50：NaHCO3胁迫处理+50 μmol·L-1MT；(4)MT100：NaHCO3胁迫处理+100 μmol·L-1MT；(5)MT150：NaHCO3胁迫处理+150 μmol·L-1MT；(6)MT200：NaHCO3胁迫处理+200 μmol·L-1MT；(7)MT300：NaHCO3胁迫处理+300 μmol·L-1MT；(8)MT400：NaHCO3胁迫处理+400 μmol·L-1MT；(9)MT500：NaHCO3胁迫处理+500 μmol·L-1MT。以上处理中，NaHCO3的施用浓度为50 mmol·L-1，直接添加至营养液中。MT以叶面喷施的方式施用，于每天20∶30进行喷施处理，喷施标准以刚刚形成水滴滴落为宜。试验采用单因素完全随机区组设计，每个处理3次重复，每个重复测定5株。于处理6 d后测定各项指标。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 叶绿素及类胡萝卜素含量的测定 采用95%乙醇浸提色素法：用95%乙醇浸提叶片，避光待测。提取液分别在665、649 nm及470 nm下测定吸光度，参照严衍禄等[9]方法计算叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)及类胡萝卜素含量。

叶绿素a浓度(Ca)=13.95A665-6.8A649

叶绿素b浓度(Cb)=24.96A649-7.32A665

叶绿素a+b浓度(Ca+b)=18.16A469+6.63A665

类胡萝卜素浓度=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/248

式中，C为色素浓度(mg·L-1)；V为提取液体积(L)；N为稀释倍数；W为样品鲜重(g)。

1.3.2 光合气体交换参数的测定 于上午10∶00—12∶00进行光合气体交换参数的测定。选番茄幼苗第四片功能叶，使用Li-6800便携式光合仪(美国LI-COR公司生产)测定其净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)，并计算气孔限制值Ls(Ls=1-Ci/CCO2)(CCO2为大气CO2浓度，取350±5 μmol·mol-1)。每个处理重复3次，每个重复测量3次。测量环境：温度为25℃，光照强度为1 000±10 μmol·m-2·s-1。

1.3.3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定与JIP-test计算 将番茄整株采回，暗处理2 h后，采用M-PEA(Multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(Hansatech，英国)，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m-2·s-1)下，对被标记的第四片功能叶进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)的测定和绘制，荧光信号记录至3 s结束，记录的初始速率为每秒1×105个数据。参照SCHANSKER等[10]的方法进行叶绿素荧光诱导动力学参数分析(JIP-test)，JIP-test 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的参数含义及推导公式见表1。

表1 JIP-test 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)的参数

1.4 数据分析

利用Microsoft Excel 2010和SPSS 19 对数据进行统计分析，利用Origin 2018绘图。

采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比较法分析各处理间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度褪黑素处理对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片叶绿素含量的影响

由表2可知，与CK相比，MT0处理下番茄叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b以及类胡萝卜素含量均无显著变化；与MT0胁迫相比，MT150处理的叶绿素a和叶绿素a+b含量显著提高。其他处理对叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量无显著影响。此外，与MT0胁迫相比，7个不同浓度的MT处理对类胡萝卜素含量均无显著影响。

2.2 不同浓度褪黑素处理对NaHCO3胁迫下番茄幼苗光合特性的影响

如图1所示，与CK相比，MT0处理下的净光合速率(Pn)显著下降了66.21%；与MT0相比，除MT500处理外，其他浓度的MT处理均可显著提高番茄幼苗叶片的Pn，说明一定浓度(50～400 μmol·L-1)的MT可缓解碱胁迫对番茄幼苗叶片Pn的抑制作用，其中又以MT100、MT150和MT3003个处理的效果最好，且3个处理间无显著差异。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

由图2可知，与CK相比，MT0处理下番茄幼苗的气孔导度(Gs)显著降低了82.36%；与MT0相比，MT100、MT150、MT300和MT4004个处理下的Gs值显著提高，MT50和MT500处理下的Gs值显著降低。其中MT100和MT150处理的Gs值最高，显著高于其他浓度的MT处理，且MT100和MT150处理间无显著性差异。

图2 不同浓度MT对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片气孔导度的影响

由图3可知，与CK处理相比，MT0处理导致番茄幼苗的胞间CO2浓度(Ci)显著提高、气孔限制值(Ls)显著降低；与MT0处理相比，7个不同浓度的MT处理的Ci和Ls值分别均显著降低和提高，其中MT100处理的Ci值最高，但与MT400处理间无显著性差异，却显著高于其他浓度的MT处理。MT200和MT500处理的Ci值最低，且两处理间无显著性差异。

图3 不同浓度MT对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片胞间CO2浓度与Ls值的影响

以上结果说明MT100、MT150、MT300和MT400处理可通过保持较高Gs和降低Ci而提高Pn，从而有效缓解了碱胁迫带来的光合伤害和光合速率降低。

2.3 不同浓度褪黑素对NaHCO3胁迫下番茄幼苗OJIP曲线的影响

快速叶绿素荧光信号的瞬时变化反映了暗反应活化前PSⅡ的光化学反应过程。图4(A)(见92YE页)为O相(Fo点)与P相(Fm点)之间的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)。由图4(A)可知，与CK相比，碱胁迫处理(MT0处理)导致O和K相提高，J、I和P相及J～P间的振幅降低，从而使OJIP曲线变缓；与MT0相比，7个不同浓度的MT处理均使OJIP曲线的J、I和P相及J～P间的荧光强度振幅提高，其中尤以MT200处理的OJIP曲线的J～P间的荧光强度增幅与I和P相最高。此外，除M50处理下的O相较MT0降低外，其他浓度处理均不同程度提高了O相。

由图4(B)(见92YE页)可知，与CK相比，MT0处理的最小荧光产额(Fo)增加，最大荧光(Fm)和最大量子效率(Fv/Fm)显著下降；与MT0相比，7个不同浓度的MT处理均可不同程度提高Fm和Fv/Fm，其中以MT200的Fv/Fm与Fm值最高，分别提高了56.48%和21.22%。

注：O: t=20 μs时的荧光；K: t=300 μs时荧光；J: t=2 ms时荧光；I: t=30 ms时荧光；P: t=300 ms时荧光。下同。

图5为不同处理下达到最大荧光(Fm)所需的时间(Tfm)。当植物受到伤害时，会造成Fm值降低，Tfm值提高。由图5可以看出，与CK相比，MT0处理显著提高Tfm；与MT0处理相比，除MT150处理外，其他不同浓度的MT处理的Tfm值均较MT0处理显著降低，其中尤以MT100的Tfm值最低。

图5 不同浓度MT对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片Tfm与Fm的影响

以上结果表明碱胁迫导致番茄幼苗叶片光合机构破坏、PSII之间的电子传递和光化学效率下降，而外源施用不同浓度的MT可不同程度保护碱胁迫下番茄叶片光合机构和提高PSII的电子传递和光化学效率。

图6 不同浓度MT对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片Vt、ΔVt的影响

2.4 不同浓度褪黑素对NaHCO3胁迫下番茄叶片JIP-test参数的影响

图7 不同浓度MT对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片JIP-test参数的影响

2.4.2 PSII比活性和能量分配 PSII的比活性参数可以反映光合器官结构的活性大小，通过活跃的单位反应中心(RC)和单位受光面积(CS)的量子效率来比较不同处理下光合结构的状态。由图8(A)可知，与CK相比，MT0下单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、捕获的能量(TRo/RC)和热耗散能量(DIo/RC)分别提高了46.17%、10.96%和68.00%，而单位反应中心传递的能量(ETo/RC)下降了23.99%，表明碱胁迫处理降低了番茄幼苗叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，而增加了热耗散的能量份额以降低碱胁迫引起的对光合机构的伤害；与MT0相比，除MT50与MT500处理对ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC和ETo/RC无显著影响外，其他浓度的MT处理均降低了ABS/RC、DIo/RC，提高了ETo/RC。说明100～400 μmol·L-1MT处理能优化碱胁迫下叶片光能的分配，增强电子传递的能力。

由图8(B)可以看出，MT0处理下单位受光面积吸收的能量(ABS/CSo)和热耗散能量(DIo/CSo)均较CK显著上升，而单位受光面积的捕获的能量(TRo/CSo)、传递的能量(ETo/CSo)分别较CK下降了6.65%与33.71%；与MT0相比，7个不同浓度MT处理均逆转了碱胁迫对ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo的影响，其中尤以MT150处理的作用最大。说明碱胁迫下叶片单位受光面积用于电子传递的能量份额减少，电子传递受阻，导致热耗散的能量份额增加，而外源施用MT可缓解碱胁迫对单位受光面积的能量流分配和电子传递效率的影响。

图8 不同浓度MT对NaHCO3胁迫下番茄幼苗叶片PSII比活性参数的影响

3 讨 论

新疆属于盐碱多发地区，土壤盐渍化是植株受到盐碱伤害的关键胁迫因子，通常情况下盐碱胁迫会阻碍植株叶片叶绿体色素的合成与积累[11]，加速叶绿素的降解。在本研究中发现，50 mmol·L-1NaHCO3胁迫对番茄幼苗的叶绿素含量无显著影响(表2)，主要原因可能由于NaHCO3胁迫浓度偏低或胁迫未达到一定的处理时间，因此低浓度或短时间处理后番茄表现出补偿生长效应[12]，使得胁迫下的叶绿素仍保持了一定的合成量，这与李子英等[13]对低盐浓度条件下(50、100 mmol·L-1)柳树幼苗叶绿素a、b质量分数研究的结论一致。

叶片是植株光合作用的重要部位，为植株提供光合产物与能量，保证了植物的正常生长与发育。本试验表示，NaHCO3的胁迫导致了叶片Gs与Ls降低，提高了Ci，最终显著抑制了番茄的Pn，FARQUHAR[14]等提出，若Ls下降说明光合能力的限制因素是非气孔限制，本试验中，NaHCO3的胁迫降低了Ls,说明胁迫使Pn下降的主要原因是由于非气孔限制导致了番茄光合能力的下降，此结论与高冠龙、王芳等[15-16]的结论一致。同时，也有研究认为，气孔限制也会导致植物的净光合速率降低，如张远兰等[17]研究证明气孔限制是苦楝受盐胁迫后光合速率降低的主要因素，李海波等[18]研究盐胁迫下‘秋光剑叶’的光合参数变化结果也与张远兰等的研究一致，尹赜鹏等[19]也发现盐胁迫下的番茄幼苗由于根系活力受到影响，导致部分气孔关闭，最终使光合速率下降，说明导致净光合速率下降的主要原因是气孔限制还是非气孔限制，还需要以特定的材料与环境而具体分析。但在本研究中，碱胁迫下的幼苗经100、150、300 mmol·L-1和400 mmol·L-1MT处理后可通过保持较低细胞CO2浓度和增加气孔导度而提高净光合速率，从而缓解了碱胁迫带来的非气孔限制(图1～图3)。

大量研究表明，一定程度的胁迫会使PSII反应中心受损，最终导致光合速率下降。比活性的值也可以确切地反映植物光合器官对光能的吸收、转化和耗散情况[28]。本试验研究发现，NaHCO3胁迫对PSII反应中心抑制作用显著，同时也造成了光合效率的降低，而外源MT处理可通过降低单位反应中心ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC，提高ETo/RC，说明外源MT使热耗散降低，增加电子传递效率，此结论与魏晓东等[29]研究干旱胁迫下银杏叶片荧光特性结论类似，单位受光面积(CS)中ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo降低和增加的趋势与单位反应中心(RC)变化相似，MT150与MT200处理对碱胁迫处理均有缓解作用，它们优化了MT0下叶片光能的分配，最终缓解了胁迫带来的伤害。

4 结 论

综上所述，50 mmol·L-1NaHCO3(MT0)胁迫处理导致番茄幼苗叶片的OEC和 PSII受体侧损伤、PSII反应中心活性、电子传递效率和光化学效率降低，从而使Pn降低。而100～400 μmol·L-1MT处理能不同程度地缓解NaHCO3对番茄幼苗带来的伤害，表现为不同程度增强了PSII的电子传递和光化学效率，优化了碱胁迫下叶片单位反应中心和单位受光面积的能量流分配，稳定和保护了碱胁迫下光合机构，从而缓解了碱胁迫诱导的PSII反应中心伤害，最终导致Pn在一定程度上的提高。经综合比较分析，以150 mmol·L-1MT处理(MT150处理)的缓解效应最为显著。