分泌性中耳炎胰蛋白酶与胃蛋白酶检测在临床诊断中的价值△

韩磊 赵泽祺 赵振鹿 李婷 乔月华1,,3

(1.徐州医科大学 徐州 221000；2.徐州医科大学附属医院耳鼻咽喉科 徐州 221004；3.江苏省人工听觉工程实验室 徐州 221000；4.徐州医科大学生命科学学院 徐州 221000；5.江苏省宿迁市第一人民医院耳鼻咽喉科 宿迁 223812；6.徐州市儿童医院耳鼻咽喉科 徐州 221002)

分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)发病率较高，为儿童就诊的第二大常见原因[1]。据报道，大约90%的学龄前儿童曾患SOM[2]。SOM会导致鼓膜活动受限和传导性听力损失，如果治疗不当或不治疗，可能会导致后遗症和并发症，如鼓膜内陷、鼓室硬化、粘连性中耳炎、永久性听力损失以及言语和语言发育障碍[3]，是导致儿童后天性听力损失的最常见原因。目前研究认为，SOM的病因是多因素的，常见的有感染[4]、变态反应[5-6]、免疫因素[7]、气压损伤[8]等。儿童由于咽鼓管接近水平，管腔较短，约为成人的1/2，且内径较宽，故咽部较易经此管连接中耳。有学者[9-11]在SOM患者的中耳积液中发现了远高于血清浓度的胃蛋白酶原，且多伴反流性咽喉炎(laryngopharyngeal reflux,LPR)。中耳乳突黏膜无分泌胃蛋白酶功能，提示中耳腔积液的胃蛋白酶可能是通过咽鼓管进入中耳腔。LPR是SOM的重要致病因素[12-13]。LPR是指胃内容物异常反流入咽、喉及上呼吸道而引起的一种慢性症状或黏膜损伤。胃蛋白酶、胃酸以及胰蛋白酶等均可损伤咽喉黏膜组织[14]。胃蛋白酶的最适pH值是1.8～3.5，而胰蛋白酶的最适pH值是7.8～8.5[15]。由于中耳腔的pH值接近中性，故胰蛋白酶的危害可能比胃蛋白酶更大。24 h喉咽食管pH值监测和咽部pH监测(DX-pH)是目前客观的诊断手段。DX-pH检测为侵入性检测，较为昂贵，且检查过程不适感较强，部分患者不能接受。目前常使用主观的反流症状指数(reflux symptom index,RSI)评分量表作出初步诊断。RSI因其简便准确[16]，成为LPR最常用的诊断和评估手段。本研究使用RSI进行反流症状的评估，并使用免疫印迹(Western blot,WB)实验验证儿童与成人SOM中耳积液中是否存在胰蛋白酶与胃蛋白酶，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进一步测定中耳积液中胰蛋白酶与胃蛋白酶含量，比较儿童与成人中耳积液中胰蛋白酶与胃蛋白酶阳性率及浓度差别，分析胰蛋白酶与胃蛋白酶检测在临床诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究纳入2020年1月～2021年5月宿迁市第一人民医院收治的30例单侧SOM患者为儿童组(年龄3～9岁)，徐州医科大学附属医院收治的30例单侧SOM患者为成人组(年龄26～54岁)。同期不伴中耳炎的10例正常人(年龄18～35岁)纳为对照组。

病例入选标准：接受纯音测听(成人)或者听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR；儿童)、声导抗、耳镜检查等，诊断为单侧SOM患者。排除标准：2周内服用过抑酸药物、慢性化脓性中耳炎、鼓膜穿孔、耳部肿瘤以及胰腺炎患者等。

1.2 标本采集 儿童组：患儿全身麻醉后，在内镜下选择鼓膜前下象限切开鼓膜2～3 mm，用无菌吸引器缓慢抽吸鼓室积液。成人组：患耳朝向术者，清理外耳道；以7号针头于鼓膜前下象限穿刺；固定针头，缓慢抽吸鼓室积液。抽吸鼓室积液后，迅速取一部分进行细菌培养和pH值测定，剩余部分置于1.8 mL无菌冻存管内，-80 ℃保存备用。对照组：在电子鼻咽镜辅助下，鼻咽拭子经总鼻道至鼻咽部，在咽鼓管咽口蘸取分泌物，1 mL生理盐水洗脱至1.8 mL无菌冻存管，-80 ℃保存备用。

1.3 基本情况表和RSI量表 在专业医师指导下，所有受试者均完成基本情况表和RSI量表。基本情况表包括患者年龄、性别、病程、近期药物使用情况、既往史等。儿童在家长配合下完成。成人自行完成。RSI评分＞13分视为阳性。

1.4 WB实验 WB实验使用Abcam公司的兔单克隆抗体。离心管预冷，样品解冻后，取部分样本至预冷离心管内，加入蛋白酶抑制剂及裂解液，于冰上裂解30 min。离心(12 000 r/min，4 ℃，5 min)后取上清至新的预冷无菌管内，加入loading buffer，混匀。100 ℃煮沸10 min。将制作好的样品加入样品孔，依次进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显影。

1.5 ELISA ELISA检测使用武汉云克隆科技股份有限公司的ELISA试剂盒。按照ELISA试剂盒说明书，样品加入样品孔后，37 ℃温箱孵育1 h，然后加入显色剂显色，终止液终止反应，依序测量各孔的吸光度值(OD值)，根据标准曲线的直线回归方程式，计算样品中胃蛋白酶及胰蛋白酶浓度。

1.6 统计学处理 资料采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料均经Shapiro-Wilk检验。符合正态分布的资料，以均数±标准差()表示，样本间比较采用独立样本t检验。不符合正态分布的资料，以中位数表示，样本间比较采用Mann-Whitney检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 儿童组和成人组RSI评分比较 儿童组中有6份(20%)RSI评分为阳性，成人组中有10份(33.33%)RSI评分阳性，对照组RSI评分均为阴性。

2.2 WB结果 儿童组中19份(63.33%)为胰蛋白酶阳性，24份(80.00%)为胃蛋白酶阳性。成人组中18份(60.00%)胰蛋白酶阳性，22份(73.33%)胃蛋白酶阳性。不论儿童还是成人，胰蛋白酶阳性的样本中均同时检测到胃蛋白酶。对照组样本中均未检测到胰蛋白酶和胃蛋白酶。详见图1。

图1 儿童组与成人组中耳积液中胰蛋白酶和胃蛋白酶WB结果

2.3 ELISA结果

1)胰蛋白酶浓度：儿童组为(517.85±266.62)ng/mL(127.89～1 084.77 ng/mL)；成人组为(400.50±206.15) ng/mL(81.51～998.29 ng/mL)，2组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2)胃蛋白酶浓度：儿童组为(87.12±22.38) ng/mL(52.56～122.32 ng/mL)，成人组为62.63 ng/mL(中位数，48.14～142.34 ng/mL)，儿童组高于成人组(P<0.05)。

详见表1。

3 讨论

儿童SOM合并LPR者的反流症状相比于成人不易察觉。部分SOM合并LPR的患者，并不表现LPR的反流症状[17-18]。本研究儿童组与成人组分别纳入30例SOM患者。胃蛋白酶阳性考虑为SOM合并LPR。RSI评分>13分为阳性，即有反流临床表现。儿童组有24例胃蛋白酶阳性，而仅有6例RSI评分为阳性；成人组有22例胃蛋白酶阳性，仅10例RSI评分阳性。儿童限于言语表达能力，一系列LPR症状，如吞咽食物和饮水不利、咽喉异物感、胃灼热、胸痛、胃痛等更加不易被家长察觉。

有研究[19]发现，中耳积液样本中平均白蛋白浓度与血清中浓度相似，而胃蛋白酶浓度远远超过血清，这表明中耳腔中胃蛋白酶并非从血清中漏出。崔婷婷等[20]的研究显示正常人血清胰蛋白酶参考水平为0.6～1.2 ng/mL。本研究中胰蛋白酶浓度明显高于血清，也验证了中耳积液中的胰蛋白酶并非来自血清。此外，我们在儿童组和成人组都观察到，胰蛋白酶阳性的样本中胃蛋白酶也是阳性。考虑胰蛋白酶在胰液中，位于小肠，相比于胃液中的胃蛋白酶，反流事件中胰蛋白酶不易被反流入咽喉继而进入中耳腔。结合ELISA结果可知，SOM患者的中耳积液中胰蛋白酶浓度在儿童和成人间差异无统计学意义，而儿童胃蛋白酶浓度高于成人，提示儿童SOM患者合并LPR的概率和严重程度都可能高于成人。

胰蛋白酶与胃蛋白酶检测对于儿童SOM合并LPR有重要价值。儿童的肠胃功能尚较弱，加之喜食碳酸饮料、油炸食物等刺激性食物，因此儿童LPR常有发生。LPR可进一步加重SOM[12-13]。儿童SOM患者合并LPR的概率较高，而患儿往往对病情的感知和表达能力较弱，导致前来就诊的SOM患儿，漏诊LPR的情况时有发生。此时，患儿应在进行SOM全身麻醉鼓膜穿刺抽液时，取部分中耳积液进行胰蛋白酶、胃蛋白酶检测，以避免LPR漏诊，并辅以抑酸治疗，降低SOM的复发率。