负载血管内皮生长因子的邻苯二酚壳聚糖体外药物缓释性能及抗菌性研究

韩佳岐，田 瑗，姜 秋*,袁文锦，杨 婕，董 宁

(1.吉林大学口腔医院 儿童口腔科，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 健康管理中心，吉林 长春130033)

年轻恒牙常因龋病、牙外伤或发育异常等导致牙髓感染坏死，牙根发育停止。牙髓组织工程再生是一种有潜力的多学科治疗方法，对于应用于牙髓组织工程再生中的支架材料，在生物相容性、药物负载性能、机械性能以及降解性等方面均有要求[1]，此外，还应考虑血运重建、细胞-基质相互作用、再矿化和抗菌性[2]等。壳聚糖是一种具有良好生物相容性，生物降解性和广谱抗菌性[3]的天然多糖，但在中性pH溶剂中溶解度低使其应用范围受限[4]。有研究用邻苯二酚对壳聚糖进行改性[5-6]，使壳聚糖在中性pH溶液中溶解性显著提高，生物相容性和亲水性得到优化，避免了负载重组蛋白等生物大分子药物时支架的低pH使药物变性。另外，邻苯二酚壳聚糖在组织表面有很强的黏附性[7-8]，不仅植入根管后可以附着在根管壁上，提供较稳定的结构支撑，还能促进细胞黏附。

血运重建是牙髓组织再生的关键营养基础，大量研究表明血管内皮生长因子(VEGF)在再生医学中起促血管生成的作用。然而VEGF在体内半衰期短，加入支架中则可以避免其在体内快速降解，提升疗效[9-10]。本课题组前期体外细胞实验验证，改性后水凝胶具有更好的促进细胞黏附性能[11]。本实验对邻苯二酚壳聚糖水凝胶与生物应用相关的物理性能进行表征，并研究其对VEGF的控释性能以及抗菌性，以构建理想的牙髓再生支架材料。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器壳聚糖(分子量50-190 kDa)、京尼平、3-(3,4-二羟基苯基)丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(Sigma Aldrish 公司，美国)； VEGF(Proteintech公司，美国)；渗析袋(3500W)(Biosharp公司，中国)；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司，中国)；哥伦比亚血琼脂培养基(温州康泰生物科技有限公司，中国)；脑心浸液肉汤培养基、维生素K1(青岛海博生物技术有限公司，中国)；琼脂粉、氯化血红素(上海生工生物科技有限公司，中国)；傅里叶红外光谱仪(Bruker公司，美国)；酶标仪(Bio-TEK公司，中国)；恒温细胞培养箱(SANYO公司，日本)；无菌超净台(安泰技术有限公司，中国)；旋转流变仪(Discovery HR-2，TA Instrument，美国)；接触角测定仪(DataPhysics Instruments，美国)。

1.2 EDC偶联法制备邻苯二酚壳聚糖配制60 ml 1%(w/v)壳聚糖溶液，调节溶液pH值至5.0。称取 0.145 g 3-(3,4-二羟基苯基)丙酸溶于15 ml乙醇中，0.356 g EDC溶于15 ml去离子水，将两种溶液混合，在搅拌下快速加入到壳聚糖溶液中，随后调节pH值至4.8，避光继续搅拌18 h后，将反应溶液置于渗析袋(3 500 w)内，在pH=5的酸化去离子水中渗析3天[12]，冷冻干燥24 h，得到邻苯二酚壳聚糖冻干样品，化学合成反应式见图1。

图1 邻苯二酚壳聚糖合成反应式

1.3 载有VEGF的水凝胶的制备将适量的VEGF蛋白溶液加入邻苯二酚壳聚糖溶液中(最终VEGF浓度为100 ng/ml)，混匀后，滴加2%京尼平的乙醇溶液(壳聚糖与京尼平的质量比为 10∶1)，搅拌30 min，放于恒温恒湿箱中交联1 d，得到邻苯二酚壳聚糖VEGF复合水凝胶。

1.4 性能表征

1.4.1红外光谱检测 使用傅里叶红外光谱仪对壳聚糖和邻苯二酚壳聚糖进行分析，确定邻苯二酚成功接枝到壳聚糖上。

1.4.2流变性分析 使用旋转流变仪对水凝胶的力学性能逆行表征。室温下，采用震荡应变为1%，振荡频率为1 Hz的振幅扫描检测壳聚糖和邻苯二酚壳聚糖水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)随时间的变化情况。

1.4.3接触角测试 通过接触角测定仪检测充分溶胀前后壳聚糖和邻苯二酚壳聚糖水凝胶的水接触角，分析其亲水性。在室温下使用悬滴法滴加2 μl去离子水于水凝胶表面，捕获水凝胶表面上水滴的图像，并对获得的图像进行计算与分析。为了减少实验误差，在每个样品表面的三个不同点重复测量，求得接触角的平均值。将壳聚糖和邻苯二酚壳聚糖的平均接触角值进行比较。

1.5 药物体外缓释试验一定量的载药水凝胶浸于PBS中，设置三个平行实验组，分别于0.5天，1.5天，2.5天，3.5天，4.5天，5.5天，6.5天，7.5天，9.5天，11.5天，13.5天，15.5天，18.5天和21.5天的特定时间点，取1 ml上清液保存，并将剩余液体全部吸出，重新注入等体积PBS。ELISA法绘制VEGF标准曲线，测定样品中VEGF浓度，计算释放率，绘制缓释曲线。

1.6 抗菌性能测试大肠杆菌(ATCC25539，购于湖南丰晖生物科技有限公司)和具核梭杆菌(ATCC25586，购于上海保藏生物技术中心)用作试验菌，以评估水凝胶的体外抗菌活性。

1.6.1抑菌环法 在固体培养皿上涂布100 μl细菌悬浮液(1×108cfu/ml)，将水凝胶置于培养皿上，37℃温育24小时。通过观察水凝胶表面及周围有无细菌区来定性测定水凝胶对细菌的抑制作用。

1.6.2菌落计数法 将200 μl水凝胶与1 ml细菌悬浮液(106cfu/ml)混合放入5 ml EP管中，不加样品作为空白对照组。将EP管在37℃培养箱中孵育22-24 h后，对菌液进行连续稀释至1万—10万倍，取100 μl稀释后菌液涂布于固体培养基，孵育24 h，通过计算菌落数定量测定水凝胶的抑菌率(BR)。

抑菌率计算公式：BR=(B-A)/B×100%，式中：A为实验组菌落数；B为对照组菌落数。

1.7 统计学分析采用PASW 18.0软件进行统计学分析，菌落计数结果满足正态分布与方差齐性，实验组与对照组间比较采用两独立样本t检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红外光谱分析图2为壳聚糖与邻苯二酚壳聚糖的红外光谱图。从壳聚糖红外光谱图中可以看到1 154 cm-1处和1 184 cm-1处为壳聚糖中典型的C-O的伸缩振动吸收峰，1 658 cm-1和1 613 cm-1分别对应酰胺Ⅰ基和酰胺Ⅱ基的振动吸收峰。与壳聚糖相比，邻苯二酚壳聚糖的谱图在波长1 500 cm-1-1 700 cm-1处出现明显差异：在1 523 cm-1处出现了新的吸收峰，为芳香族C=C骨架的振动吸收峰[12]，证明邻苯二酚成功接枝到壳聚糖分子上。

2.2 流变性分析图3为壳聚糖与邻苯二酚壳聚糖水凝胶流变性能图，在频率为1 Hz的振荡下，随着时间的延长，壳聚糖与邻苯二酚壳聚糖的水凝胶材料的储能模量(G’)始终大于损耗模量(G”)，证明材料始终处于凝胶状态。并且邻苯二酚改性后壳聚糖的G’显著提高，从3 000 Pa增加到13 000 Pa，G”也具有类似的变化趋势。表明邻苯二酚壳聚糖比壳聚糖具有更好的弹性性能，结构更稳定。

2.3 亲水性检测去离子水液滴和水凝胶表面之间测得的接触角能反映材料表面润湿性。接触角值越小，表明材料表面的润湿性越高，亲水性也越强。如图4所示，接触角测试中，当水滴与充分溶胀前的邻苯二酚壳聚糖水凝胶表面接触时，水滴瞬间铺展，被水凝胶吸收；而溶胀前壳聚糖的水接触角为24.0°±0.5°，具有一定的亲水性，但其性能低于改性后壳聚糖。充分溶胀3天后，邻苯二酚壳聚糖和壳聚糖的水接触角分别为15.9°±2.7°和67.2°±2.9°，虽均有升高，但邻苯二酚壳聚糖的水接触角仍明显低于壳聚糖。以上结果表明邻苯二酚改性后壳聚糖的亲水性得到显著提高。

图2 壳聚糖和邻苯二酚壳聚糖红外光谱图(CS：壳聚糖；Cat-CS：邻苯二酚壳聚糖。Cat-CS的谱图在波长1 523 cm-1处出现芳香族C=C骨架的振动吸收峰，证明邻苯二酚成功接枝到壳聚糖分子上。)

图3 壳聚糖与邻苯二酚壳聚糖水凝胶流变变化情况(Cat-CS的G’和G”均比CS显著提高，G’从3 000 Pa增加到13 000 Pa。)

2.4 体外缓释行为用ELISA法检测梯度稀释的VEGF标准品(浓度分别为800 pg/ml、400 pg/ml、200 pg/ml、100 pg/ml、50 pg/ml、0 pg/ml)在波长为450 nm处的吸光度，绘制VEGF标准曲线(图5A)，标准曲线的直线回归方程式为y=0.066 81 + 0.001 87x，样品线性回归于预期浓度相关系数R值为0.992 7。

通过ELISA试剂盒检测在21天中的特定时间点吸取的上清液的实际浓度。得到邻苯二酚壳聚糖水凝胶的药物累积释放量和累积释放率。从药物累积释放曲线(图5B)可以看出，前15天的每日药物释放量基本稳定，其中，5.5天至15.5天较前5天轻微放缓；最后一周曲线趋势逐渐趋近平缓，药物释放速率逐渐减慢，但并未停止释放。21天时药物累积释放率达到52.95 %。以上结果表明邻苯二酚壳聚糖水凝胶对药物有良好的控释作用，并且可以达到较长时间的稳定释放。

图4 溶胀前后的壳聚糖水凝胶与邻苯二酚壳聚糖水凝胶接触角变化情况(溶胀前后Cat-CS的水接触角均小于CS，Cat-CS亲水性优于CS。)

图5 邻苯二酚壳聚糖水凝胶药物缓释性能 (A:VEGF标准曲线;B:药物累积释放曲线;21天内载有VEGF的邻苯二酚壳聚糖持续释放VEGF。)

2.5 体外抗菌性能微生物感染会阻碍牙髓再生过程，因此水凝胶具有抗菌能力十分重要。使用伤口感染的常见菌E.coli和根管感染中常见的革兰氏阴性厌氧菌F.n评估水凝胶的抗菌能力。如图6A所示，邻苯二酚壳聚糖水凝胶表面及周围一定范围内未见E.coli或F.n生存。水凝胶对E.coli和F.n的抑制区直径分别为约13.5 mm和14.8 mm。

通过抑菌率的计算可以定量体现出水凝胶的抗菌性的强弱。水凝胶对E.coli和F.n处理24小时后菌落形成单位较空白对照组相比均有明显减少，差异具有统计学意义(E.coli组：t=82.814，P<0.05；F.n组：t=16.704，P<0.05)。E.coli的24小时抑菌率为93.8%，对F.n的抑菌率为86.7%，说明壳聚糖改性产物具有比较优异的抗菌性。

图6 邻苯二酚壳聚糖水凝胶抗菌性能(A：抑菌环法检测邻苯二酚壳聚糖水凝胶对E.coli与F.n的抗菌性,水凝胶在两种细菌的固体培养基上均可形成明显的抑菌环；B：菌落计数法检测邻苯二酚壳聚糖水凝胶对E.coli与F.n抗菌性,两种细菌菌液分别培养24 h后，加入水凝胶组的菌落计数明显少于空白对照组。)

3 讨论

牙髓组织工程再生中的支架材料有许多性能要求，比如在机械性能方面，支架材料的弹性模量会对间充质干细胞的分化产生影响，如血管等软组织再生需要支架材料的弹性模量约为2-15 kPa[13]。壳聚糖及其衍生物作为天然生物材料满足组织支架的基本要求和特性。由于存在氨基和两个羟基官能团，壳聚糖可以进行许多反应，例如醚化，酯化，交联等，以此进行化学和机械修饰，通过结构修饰赋予所需的特性和功能[14]。因此，尽管壳聚糖仅能在酸性条件下溶解使其应用受限，但可以通过引入水溶性材料的亲水部分等方法提高溶解度[15-16]。本研究中，通过EDC偶联反应引入邻苯二酚基团对壳聚糖进行改性，红外光谱检测显示邻苯二酚基团成功接枝到壳聚糖长链上，改性后壳聚糖可以在中性条件下溶解，在溶液中加入京尼平交联剂后形成邻苯二酚壳聚糖水凝胶，流变性分析结果显示在频率为1Hz的振荡下，水凝胶的G’和G”基本未发生变化，表明已形成了结构性质较稳定的网络结构，此外流变数据也显示出邻苯二酚壳聚糖的弹性性能比纯壳聚糖水凝胶更好。

在牙髓组织工程学中，直接将干细胞注射到根管内的再生能力很差，还需要活性细胞因子促进细胞定居及其基质沉积，因此，将活性生物分子载入具有控释性能的支架内对于它们在受损组织内的递送以及对细胞的作用至关重要。VEGF可以通过其受体介导的信号通路调控血管内皮细胞增殖、迁移，改变血管通透性，这些功能在血管生成的初期发挥重要作用，另外VEGF还具有干细胞募集的功能。但VEGF在体内的半衰期很短，向缺血部位局部注射或系统注射重组VEGF蛋白溶液的临床效果并不理想[6]，因此，人们一直在探究亲水性药物在水凝胶支架中的缓释效果和应用。本研究中，溶胀前后的邻苯二酚壳聚糖水凝胶的水接触角为0°和15.9°±2.7°，均较壳聚糖水凝胶明显减小，说明邻苯二酚壳聚糖水凝胶具有更高亲水性、含水性和更优的生物相容性。邻苯二酚对壳聚糖的修饰在载药和缓释方面的影响主要为：(1)改善壳聚糖的水溶性，避免酸性条件下VEGF变性，材料的生物相容性也有所提升；(2)对壳聚糖水凝胶亲水性的改善，进而增加水溶性VEGF的负载，并提高材料通透性。因此，邻苯二酚壳聚糖水凝胶在亲水性药物的控释载体应用方面更具优势。之前的研究表明[6]，应用于口腔黏膜给药的邻苯二酚壳聚糖水凝胶具有持续递送药物的能力。本实验在邻苯二酚壳聚糖水凝胶的合成过程中将VEGF混合其中，水凝胶网络的交联和药物负载同时进行，VEGF以溶液的形式均匀分散在水凝胶基质中并吸附于支架上，作用力为物理吸附的范德华力。本实验采用ELISA对37℃、中性pH环境下水凝胶对VEGF的累积控释进行了检测，载药水凝胶持续缓慢稳定地释放药物，未见突释现象，21天时累积释放率达52.95%，表明邻苯二酚壳聚糖水凝胶具有药物缓释能力。在亲水性药物均匀分布于水凝胶基质中的控释系统中，最常见药物释放机制是扩散，药物到达水凝胶表面附近即可释放出来，而水凝胶内部的药物扩散到表面需要一定时间，因此VEGF释放速率在实验后期逐渐减低。有研究将壳聚糖/β-甘油磷酸酯(CS/β-GP)水凝胶作为VEGF缓释体系，使用ELISA检测VEGF的8日释放曲线。结果显示前4天VEGF的每日释放量逐渐增加。从第4天开始呈下降趋势，8天后累积释放量趋于峰值，共有12%的VEGF蛋白从水凝胶中释放出来[17]。本实验中前15天内药物释放量均较稳定，21日累积释药量略低，可能由于材料适中的机械强度提高了药物在水凝胶网络中的捕获能力[18]，并且有部分VEGF可能与邻苯二酚壳聚糖发生了交联，结合在水凝胶网络中，仅通过扩散作用无法释放。

大多数牙髓和根尖周疾病是由于口腔细菌的直接或间接参与而诱发的。一项系统回顾显示，79%牙髓再生失败的临床病例是由于持续感染[19]，这表明控制根管中的细菌是再生治疗中关键的步骤。牙髓血运重建治疗中，消毒主要依靠冲洗和根管内封药的化学消毒，只有极少或没有机械预备，会导致根管内细菌残留。这些残留的细菌可以抑制干细胞分化，影响组织形成和再生过程的成功。因此，在不影响细胞功能的情况下，提高支架材料的抗菌效果，会提高再生牙髓治疗过程的成功率。

根管感染中常见革兰氏阴性厌氧菌，其细胞壁富含脂多糖，与革兰氏阳性菌细胞表面结构不同，这导致不同菌种对壳聚糖具有不同的敏感性。有研究表明，革兰氏阴性菌对壳聚糖的敏感性可能高于革兰氏阳性菌[20]。本研究使用两种革兰氏阴性菌即E.coli和F.n测试邻苯二酚改性后壳聚糖水凝胶的抗菌性能，实验结果显示邻苯二酚壳聚糖水凝胶具有良好的抗菌性，对两种细菌均可形成一定范围的抑制区域，并对浮游细菌的抗菌率分别达到93.8%和86.7%，抗菌率未达95%以上可能因为引入邻苯二酚基团消耗了壳聚糖中的部分氨基，减弱了正电荷效应，使抗菌性能稍有减弱[12]。以往纯壳聚糖及其衍生物的抗菌应用大多是作为抗生素递送载体，有研究报道壳聚糖-植物化学偶联物与红霉素等抗生素协同表现出很强的抗菌活性[21]，但也有研究发现载有抗生素的壳聚糖水凝胶会对牙髓干细胞的矿化活性产生不利影响[22]。

综上所述，本研究中成功制备出负载VEGF的邻苯二酚改性壳聚糖水凝胶，是一种具有良好亲水性和适宜的弹性模量的支架材料，具有缓释细胞因子和抗菌的双重功能，仍需要进一步对其抗菌机制和体内实验血管再生进行探索。