应用二硫苏糖醇消除达雷木单抗对输血相容性检测干扰的探讨

强新晨，杨华莹，邵俊良

(南京医科大学附属无锡人民医院，江苏 无锡214023)

多发性骨髓瘤(MM)是一种起源于骨髓的浆细胞恶性克隆增殖性疾病，好发于中老年人[1],发病率逐年增加，是血液系统较为常见恶性肿瘤。大多数患者随着近些年来免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂的临床应用后总体生存率有显著提高，患者生存质量得以改善，然而难治性和复发性骨髓瘤患者的治疗效果不尽如人意。人CD38抗原为单链Ⅱ型跨膜糖蛋白，长度为45kDa，调节细胞活化、分化和增殖[2],通常在造血干细胞、T细胞、NK细胞和树突细胞中表达，外周血中性粒细胞和B淋巴细胞不表达，骨髓瘤细胞高量表达，成为MM免疫靶向治疗药物作用的新靶点[3]。达雷木单抗(DARA)是一种针对CD38的人源免疫球蛋白(Ig)G1κ单克隆抗体，2015年成为首个获得批准用于高危性或复发性骨髓瘤患者治疗的抗-CD38单克隆抗体，具有较好的临床疗效和安全性[4-5]，中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订)中增加了DARA入选治疗方案[6-7]，联合免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂可进一步提高疗效[8]，临床使用病例数量日趋增加。

由于红细胞也表达CD38抗原分子，当患者应用DARA药物治疗时，与红细胞表面低水平表达的CD38结合，引起不规则抗体筛检、特异性抗体鉴定等输血相容性检测出现假阳性[9]，从而掩盖有价值的同种免疫性抗体。随着接受抗-CD38治疗患者例数的增多，如何消除该抗体对输血相容性检测的干扰，保障患者输血安全，成为亟待解决的难题，本文通过应用二硫苏糖醇(DTT)，结合文献[10-11]选用低浓度DTT方法处理红细胞，结合微柱凝胶法进行相关实验，消除其对输血相关血清学试验干扰，确保DARA治疗患者临床用血安全。

1 材料与方法

1.1 临床资料

病例：女性患者，59岁，确诊多发性骨髓瘤18月，2020年3月起采用硼替佐米联合地塞米松/环磷酰胺化疗5次及对症支持治疗，10月起DARA 700 mg联合地塞米松及来那度胺进行治疗，患者入院时不规则抗体筛选为阴性，因患者贫血拟输血支持治疗，输血前检测发现不规则抗体筛选及特异性抗体鉴定试验均出现泛凝集反应，显示抗体无特异性，与供血者交叉配血主侧有凝集。

1.2 试剂与仪器

试剂包括AB/D血型微柱检测卡(长春博迅生物技术公司)；微柱凝胶检测卡(IgG+C3d,美国BIO-RAD)；ABO反定型细胞(上海血液生物医药公司)；抗体筛选细胞(江阴立博医药生物技术公司)；pH7.2PBS缓冲液(飞净生物科技公司)；pH8.0PBS缓冲液(飞净生物科技公司)；1,4-二硫代-DL-苏糖醇(DTT，美国Sigma)；相容性检测质控品(长春博迅生物技术公司)；抗K试剂(江阴立博医药生物技术公司)。仪器包括37℃卡式孵育器；卡式离心机。

1.3 0.02 mol/L DTT溶液的配置

称取DTT1.0 g溶解于32 ml pH=8.0PBS缓冲液中，充分搅拌溶解后分装于PE管中，-20℃保存备用，使用时先复溶,后用pH7.2PBS缓冲液1∶9稀释。

1.4 输血相容性检测

患者AB/D血型、直接抗人球蛋白试验按照说明书要求操作，抗体筛选试验、抗体鉴定和交叉配血试验采用微柱凝胶卡法进行，将抗体筛选细胞、抗体鉴定谱细胞和献血员红细胞用生理盐水洗涤3次后制成0.8%红细胞悬液，操作步骤：在微柱凝胶卡上部反应腔内加入上述0.8%红细胞悬液50 μl和0.02 mol/L DTT溶液25 μl，用移液器仔细混匀5次，将凝胶卡在37℃孵育15 min，再加入25 μl患者血浆，用移液器仔细混匀5次，37℃孵育15 min，然后放入卡式离心机离心，观察有无凝集现象，有凝集试验为阳性。

1.5 对照试验

本研究中采用0.02 mol/L DTT处理红细胞抗原方法设立对照试验，选择表达M、Jka、E、K抗原的O型红细胞作为对照细胞，DTT处理前均确认M、Jka、E、K抗原为阳性，选用经血型参比实验室确认抗M(IgM)、抗Jka、抗E的血浆以及抗K试剂血清分别与DTT处理前/后的M、Jka、E、K抗原红细胞作为效果评估试验，操作步骤与前述相同。

2 结果

2.1 患者血型、直接抗人球蛋白试验

患者血型为O型，CcDEe,自身对照阴性，直接抗人球蛋白试验阴性；治疗后，对ABO、Rh血型分型检测无影响，自身对照阴性，直接抗人球蛋白试验阴性。

2.2 不规则抗体筛选、抗体特异性鉴定和交叉配血

DARA治疗后21天后，未经DTT处理，红细胞不规则抗体筛选Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ细胞全凝集，凝集强度1+—2+，见图1-(1)。经DTT处理后，红细胞不规则抗体筛选Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ细胞均为阴性，见图1-(2)。红细胞抗体特异性鉴定试验，结果显示均凝集，凝集强度为1+—2+，显示抗体无特异性，见图1-(3)。选取2份与患者同型血液交叉配血试验主侧为不合，凝集强度为3+，经DTT处理后交叉配血主侧相合，见图2。

图1 患者抗体筛选、抗体特异性鉴定试验结果

2.3 对照试验

抗M、抗Jka、抗E血浆和抗K血清与未经DTT处理的M、Jka、E、K抗原红细胞微柱凝胶卡反应均为阳性；与经DTT处理后M、Jka、E、K抗原细胞反应均为阳性，结果显示经处理后不影响M、Jka、E、K抗原与对应抗体的反应性，见图3。

3 讨论

由于CD38抗原在MM患者淋巴细胞上广泛高表达，CD38单克隆抗体-DARA能靶向结合肿瘤细胞上高表达CD38分子，通过介导补体/抗体依赖的细胞毒作用、诱导细胞凋亡作用等多种机制杀伤靶细胞、消除表达CD38抗原的调节性淋巴细胞和来源于髓细胞的抑制细胞达到免疫调节作用以及抑制CD38酶活性，诱导肿瘤细胞死亡，发挥抗肿瘤免疫效应[12]，已经成为MM的免疫治疗新手段，含DARA的联合化疗方案已经成为临床挽救性治疗措施[13]，能改善患者预后、延长患者总生存期。

图2 供血者 DTT处理前、后交叉配血结果

图3 M、Jka、E、K抗原红细胞DDT处理前、后抗体检出结果

由于人类红细胞表面也有少量CD38抗原表达，DARA可以和患者、供血者、抗体筛选试剂红细胞表面结合，导致患者直接抗人球蛋白试验假阳性，干扰不规则抗体筛选，抗体特异性鉴定反应呈全阳性反应，与供血者交叉配血主侧呈阳性反应，造成输血相容性检测困难，影响输血治疗[14-15]。通常情况下，抗-CD38抗体与患者红细胞结合后会导致直抗实验阳性，但是该种结合不会影响血型鉴定，本研究中患者红细胞直抗试验应用DARA前、后均为阴性结果，研究表明[16]是由于随着药物使用后(一般7天以后)抗体对红细胞表面CD38抗原清除效应逐渐显现，直抗阳性减弱甚至为阴性结果。这种对输血相容性检测的干扰可在末次使用后持续2-6个月[17]，有可能掩盖患者血浆中存在的其他同种免疫抗体，引发溶血性输血反应，给患者造成输血风险。有学者建议在患者应用DARA前预留患者血样用于治疗后续输血相容性检测，但是该策略由于血样保存时效有限和不能真实反应患者当前免疫状态，易造成新产生的同种抗体漏检。

DTT属于一种还原剂，可以还原破坏抗原蛋白质中半胱氨酸之间用于维持二级结构的二硫键，红细胞表面CD38抗原被破坏后，DARA抗体无法与之相结合，消除该抗体对输血相容性检测的干扰。经典法DTT预处理供血者红细胞方法耗时长、步骤繁琐，洗涤过程中红细胞易溶血，造成细胞表面部分抗原破坏[18]，采用本研究方法处理红细胞表面CD38抗原，结合微柱凝胶卡的方法，比常规微柱凝胶卡法交叉配血耗时仅增加15 min，省略红细胞DTT处理过程中多次洗涤，实验时间显著缩短。红细胞DTT处理前患者血浆与抗体筛选细胞、抗体特异性鉴定谱细胞表现为全阳反应，凝集强度为1+—2+，反应无特异性，与供血者交叉配血试验主侧不相合，凝集强度为3+，泛反应性有可能掩盖同种免疫性抗体的反应，存在漏检的风险。用低浓度0.02 mol/L DTT处理上述抗体筛选细胞、特异性鉴定谱细胞后，与患者血浆均为阴性反应，提示患者血浆中仅存在抗-CD38抗体，未检出其他同种免疫性抗体，与献血员交叉配血实验主侧均为相合。实验结果显示经过DTT处理后，有效消除DARA对输血相容性检测的干扰，确保接受该种药物治疗患者输血及时性、安全性。

依据我国血型意外抗体的分布情况[19-20]，红细胞血型意外抗体检出以Rh、MNS、KIDD和LEWIS系统最为常见，为验证改变DTT浓度处理抗原效果和对常见同种免疫性抗体检测能力，尤其是对IgM类抗体的影响，选择表达M、Jka、E、K抗原O型红细胞在DTT处理前、后分别与特异性人源抗M(IgM)、抗Jka、抗E和单克隆抗K进行间接抗人球蛋白实验，结果显示DTT处理后M、Jka、E、K抗原均能检出，提示本方法可以保留K抗原，与Hosokaw等[21]结果相同，M抗原反应阳性表明对IgM抗体影响较弱，DTT与抗体血清反应时间较经典方法短存在一定关系[22]。我国为多民族国家，Kell血型抗原分布存在种族差异，维吾尔族、回族和汉族K抗原阳性率分别为3.16%、1.36%、0.17%[23]，在少数民族地区抗K抗体产生几率比汉族地区高，经典法DTT处理红细胞技术存在破坏CD38以外红细胞抗原(如Kell、YT、JMH等抗原)，导致相关血型抗体漏检的局限性。通过改变DTT浓度处理红细胞，可以在保留红细胞表面K抗原的情况下消除DARA对输血相容性检测的干扰，确保K抗原阴性患者输血安全,由于样本数量较少，可行性有待进一步验证。