不同芽孢杆菌对烟株根际土壤细菌群落及根结线虫防控效果的影响

左 梅，谭 军，向必坤，施河丽，陈红华，彭五星，尹忠春

湖北省烟草公司恩施州公司，湖北省恩施市市府路65 号 445000

由根结线虫引起的病害属于土传病害，具有发生范围广、防治难度大、危害严重的特点，在我国主要烟区均有发生［1-2］。当前农业生产中根结线虫的防治仍以化学药剂为主，但长期使用化学药剂易造成环境污染，对人畜健康不利［3-4］。而微生物菌剂因其绿色环保的优势，逐渐成为现代根结线虫防控的重要手段。黄阔等［5］研究表明，淡紫拟青霉、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞杆菌3种微生物菌剂均能增加微生物群落的多样性，有效控制烟草根结线虫病害的发生。Seenivasan［6］的研究显示荧光假单胞杆菌、淡紫紫孢菌和木霉液体制剂均能在一定程度上减轻胡萝卜根结线虫病害的发生。

目前，有关芽孢杆菌用于防治农作物根结线虫及其他土传病害的研究较多［7-8］，但对芽孢杆菌的施入改变了土壤中哪些细菌群落，哪些细菌群落在根结线虫的防控中起关键作用，以及芽孢杆菌施入土壤前后植株根际土壤细菌群落结构的差异等方面的研究还鲜见报道。受微生物培养的限制，传统微生物组学分析方法不能充分揭示土壤微生物群落结构和多样性的变化规律，而宏基因组测序技术可不用进行微生物分离和纯培养，直接对特定环境中的总DNA进行提取和鉴定，理论上可获取所有环境微生物的基因信息，从而反映环境中微生物群落的结构和代谢状况［9］。因此，选取3 种不同的芽孢杆菌（分离筛选自恩施植烟土壤）微生物菌剂施于烟田，利用宏基因组测序技术分析施用该微生物菌剂对烟株根际细菌群落的影响，并对比施用不同菌剂后烟田根结线虫病害的发病程度，旨在为如何利用微生物菌剂防控烟田根结线虫提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烟草品种为云烟87。供试菌株1 000 亿活孢子/g B3 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus B3）、1 000亿活孢子/g B9 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus B9）、1 000亿活孢子/g S2蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides S2）均由华中农业大学赵秀云老师团队从恩施烟区的烟田中分离筛选获得。B3 蜡样芽孢杆菌和B9 蜡样芽孢杆菌虽同为蜡样芽孢杆菌，但菌株形态与杀虫活性不同。

1.2 试验设计

试验于2019年在湖北省宣恩县椒园镇水井坳村3组进行。当地常年种植烤烟，且受根结线虫影响严重，土壤中根结线虫数量为5～150 头/g。试验地地势平坦，土壤为山地黄棕壤，有机质含量24.75 g/kg，碱解氮含量138.45 mg/kg，速效钾含量149.32 mg/kg，有效磷含量23.60 mg/kg。

试验设置 4 个处理，分别为：T1，B3 蜡样芽孢杆菌；T2，B9蜡样芽孢杆菌；T3，S2蕈状芽孢杆菌；T4，清水对照（CK）。上述微生物菌剂1.5 kg 兑水150 L溶解成混合菌液，分别将3种混合菌液和等量清水对照于烟苗移栽10 d 后进行灌根处理，每株150 mL。每个处理3 次重复，每个小区面积37.6 m2，随机排列，周围设置保护行。烟苗于2019年5月1日移栽，除4种试验处理外其他管理均按常规措施进行。

1.3 样品采集

烟叶成熟采收后，各小区随机选取15株烟株，挖出其完整根系，采取抖落法除去表面较大土壤团块及根系上松散粘附的土壤颗粒，再用干净的毛刷刷取根系周围约2 mm 粘附的土作为根际土。每5 株的根际土混合为1个样品，即每个小区3个样品。将样品土壤过20目网筛去除植物碎片等残体，均匀混合后收集在无菌自封袋中，每个样品分2份分装，在2～4 ℃下转移至实验室进行前处理，分别用于宏基因组测序和线虫密度指标分析。

1.4 测定内容与方法

1.4.1 宏基因（Metagenomics）组测序分析

将分装好的其中1 份土壤样品转移至塑料离心管并置于液氮罐中冷冻干燥后取出，再用干冰储存送往北京诺禾致源有限公司进行宏基因组测序分析。DNA 样品经提取并采用Qubit®2.0 Flurometer（美国Life Technologies 公司）检测合格后，使用Covaris ME220超声波破碎仪（美国Covaris公司）随机打断，再经末端修复、加A 尾、加测序接头、纯化、PCR扩增（Bio-Rad T100 PCR扩增仪，美国Biorad公司）等步骤进行文库制备。本批次文库接头序列为5′Adapter：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACAC（index）TCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT-3′，3′Adapter：5′-GATCGGAAGAGCACA CGTCTGAACTCCAGTCAC（index）ATCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG-3′，其中下划线部分为锚定序列，非下划线部分为引物序列。检测合格的文库将采用Illumina PE150 测序仪（美国Illumina 公司）进行测序，测序得到的下机数据（Raw data）将用于后期信息分析。测序分析通过去除低质量碱基的reads，采用Bowtie2 软件过滤源于宿主的reads 等手段得到可用于后续分析的有效数据（Clean data）。对于预处理后得到的Clean data 使用SOAP denovo组装软件进行组装分析（Assembly analysis），组装生成的Scaftigs，过滤掉500 bp 以下的片段，并进行统计分析和后续基因预测。

1.4.2 线虫密度分析

将分装好的另外1 份土壤样品送往中国科学院微生物研究所测定南方根结线虫密度。参照文献［10］提取土壤样品DNA，利用设计的南方根结线虫特异性引物和标记进行实时荧光定量PCR 分析［11］。根据循环阈值（Ct 值）计算土壤中南方根结线虫密度。

1.4.3 根结线虫发病率与病情指数调查方法

烟田烟草植株根结线虫病害严重程度分级标准为：根部正常的烟株为0 级；少于1/4 的根上有少量根结的烟株为1级；1/4至1/3的根上有少量根结的烟株为 3 级；1/3 至 1/2 的根上有根结的烟株为 5 级；多于1/2的根上有根结，少量次生根上有根结的烟株为7 级；所有根上（包括次生根）长满根结的烟株为9级。

1.4.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007 软件进行数据整理，使用DPS 7.65 软件对数据进行Tukey法差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤细菌在门水平上的群落组成分析

由图1 可见，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）在4个处理中的丰度之和均超过95%。其中变形菌门（Proteobacteria）丰度以 T1 处理最高，T2、T3 处理次之，CK处理最低。放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）丰度则均以CK 处理最高，其中放线菌门（Actinobacteria）以T2、T1次之，T3最低；酸杆菌门（Acidobacteria）则以T2、T3 处理次之，T1 最低。蓝细菌门（Cyanobacteria）具有固氮和抵抗不良环境的功能，在T1、T3 处理中丰度明显高于CK 处理，且在T3处理中最高。硝化螺旋菌门（Nitrospirae）为T1 处理中特有的细菌门类，其丰度达0.02%。该菌门中的硝化螺旋菌属（Nitrospira）［13］作为硝化细菌，可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，有益于植物的生长发育。

图1 不同芽孢杆菌处理土壤中主要细菌门的相对丰度Fig.1 Relative abundances of major bacterial phyla in soils under different Bacillus treatments

2.2 不同处理土壤细菌在属水平上的群落组成分析

图2 为各处理烟田土壤中相对丰度超过2%的10 个 属 ，柄 杆 菌 属（Caulobacter）、鞘 脂 菌 属（Sphingobium）、贪噬菌属（Variovorax）和红假单胞菌属（Rhodopseudomona）为各处理土壤中的优势菌属。 相比3 种加菌处理，CK 处理中类诺卡氏属（Nocardioides）丰度最高，贪噬菌属（Variovorax）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）和罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）丰 度 最 低 。 类 诺 卡 氏 菌 属（Nocardioides）可降解水体或土壤中的吡啶、呋喃、除草剂等有害有机物［14］。贪噬菌属（Variovorax）为高产铁载体的主体菌属，具有一定的固氮功能［15-16］，为土壤中的有益菌属，在T1处理中丰度最高。亚硝化螺菌属（Nitrosospira）耐氨，在土壤中参与硝化作用［17］，在T2 处理中丰度最高。 罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）具有降解纤维素的功能，在T1 处理中最高。Granulicella、柄杆菌属（Caulobacter）、红假单胞菌属（Rhodopseudomona）和中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）在T3处理中丰度最高。伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）属，在T2 处理中丰度最高，该属的一些细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能［18］。

图2 不同芽孢杆菌处理土壤中主要细菌属的相对丰度Fig.2 Relative abundances of major bacterial genera in soils under different Bacillus treatments

2.3 不同处理土壤细菌群落在种水平上的主成分（PCA）聚类分析

对不同处理土壤细菌群落结构在种水平上的物种丰度进行主成分聚类分析，分别提取2个主成分，贡献率分别为58.00%和20.00%（图3）。由图3 可见，添加芽孢杆菌的3 个处理（T1、T2、T3）的所有样本均能较好地与CK 处理分离，说明加菌处理与CK处理样本中的微生物种群差异较大。3 种加菌处理间的某些样本虽有重叠，但也存在较大差异。

图3 基于细菌种水平的主成分PCA分析结果Fig.3 Results of PCA analysis at species level

2.4 不同处理细菌群落鉴定对比分析

通过Metaphalan方法从各处理土壤中获取主要菌种208种，其中属54个，种65个。不同加菌处理与CK 处理中菌种的分布关系见图4。由图4 可知，加菌处理的细菌种数均大于CK 处理（103 种），且最多的为T1处理（119种），其次为T3处理（113种），最少的为T2 处理（111 种）。加菌处理与CK 处理共有菌种数最多的为T3 处理（70 种），其次为T1 处理（65种），共有菌种数最少的为T2处理（59种）。而与CK处理相比特有菌种数最多的为T1处理，其次为T2处理，最少的为T3处理。

图4 不同芽孢杆菌处理对土壤中细菌种数的影响Fig.4 Effects of different Bacillus treatments on soil bacterial species

2.5 不同处理存在显著差异细菌类群的差异分析

分别将添加不同芽孢杆菌的处理与CK 处理两两组合进行分组，通过LDA（线性判别分析）筛选出不同分类水平上在各组中存在显著差异的细菌类群（图5），相关类群丰度统计结果见表1。由表1和图5可知，各组间存在显著差异的微生物类群差异较大。放线菌目（Actinomycetales）均在A组（T1-CK）、B组（T2-CK）及C组（T3-CK）3组中的CK处理中显著高于加菌处理，而放线菌目类诺卡氏科（Nocardioidaceae）和微杆菌科（Microbacteriaceae）仅在A组与B组中的CK处理中丰度显著高于对应加菌处理。在A 组中假单胞菌科（Pseudomonadaceae）和伯克霍尔德氏菌目无名科（Burkholderiales_noname）在加菌处理T1中显著高于CK处理，在CK处理中未检测到该群落，而链霉菌科（Streptomycetaceae）则相反，该菌在CK处理中的丰度显著高于T1。C组中微杆菌科（Microbacteriaceae）在加菌处理T3 中显著高于CK 处理，其丰度为CK 处理的2.63 倍。可见，在土壤中添加芽孢杆菌后改变了土壤中的细菌菌群结构，且不同的芽孢杆菌对土壤的细菌群落结构的影响不同。

图5 不同组间细菌类群聚类树Fig.5 UPGMA trees of different groups

表1 不同分组在不同分类水平上存在显著差异的细菌类群丰度Tab.1 Bacterial groups with significant differences in abundance at different levels of classification

2.6 不同芽孢杆菌处理对烟草根结线虫病害的防控效果

由表2可见，施用3种芽孢杆菌的土壤中根结线虫虫口密度均低于CK 处理，其中T1 处理的根结线虫虫口密度最低，且T1 和T3 处理显著低于CK 处理。各处理的线虫病情指数均显著低于CK 处理。而不同加菌处理中T1 处理根结线虫发病率和病情指数最低，且显著低于T3 处理，T2 处理居中。说明施用3种芽孢杆菌均能不同程度降低根结线虫虫口密度、发病率和病情指数，且B3 蜡样芽孢杆菌的效果最好。

表2 不同处理对根结线虫防治效果的影响①Tab.2 Effects of different treatments on control effect of root-knot nematodes

3 讨论

从门水平和属水平上对添加不同芽孢杆菌的根际土壤细菌群落结构进行分析，发现B3蜡样芽孢杆菌能增加土壤中有益菌门硝化螺旋菌门（Nitrospirae）和有益菌属贪噬菌属（Variovorax）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）的丰度，B9 蜡样芽孢杆菌能增加有益菌属亚硝化螺菌属（Nitrosospira）的丰度，S2 蕈状芽孢杆菌能增加有益菌属红假单胞菌属（Rhodopseudomona）和中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）的丰度。贪噬菌属（Variovorax）为高产铁载体的主体菌属，而在营养竞争中铁载体对铁的竞争常作为很多生防细菌抑制植物病原真菌的重要特征［8］。因而贪噬菌属（Variovorax）能帮助宿主菌竞争Fe元素，抑制线虫病原菌的生长，从而抑制根结线虫病害的发生。亚硝化螺菌属（Nitrosospira）与硝化螺旋菌门（Nitrospirae）下的菌属在土壤中参与硝化作用，为烟株的生长提供养分，从而增强烟株抵抗病原菌的抗逆性。

通过对添加不同芽孢杆菌的土壤与对照土壤中的菌种群落进行检测分析，发现不同种类的芽孢杆菌均能不同程度增加土壤中的细菌种类，其中添加B3 蜡样芽孢杆菌处理的总菌种数与特有菌种数最大，细菌菌群最为丰富。另外通过对加菌处理与CK处理中差异显著的细菌类群进行分析，结果表明相比CK 处理假单胞菌科（Pseudomonadaceae）在B3 蜡样芽孢杆菌处理土壤细菌群落中的丰度显著高于CK 处理，而假单胞菌是抑制根结线虫病害的有益微生物，已用作研制作物生产中防治线虫的生防菌剂［19］。在土壤中施入B3蜡样芽孢杆菌后，增加了土壤中总体细菌菌群多样性，特别是增加了其中有益菌的相对丰度。黄阔等［5］的研究结果表明枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉、荧光假单胞杆菌均能够促进土壤微生物群落对碳源的整体利用，提高微生物群落的多样性，与本研究结论基本一致。而微生物菌群越丰富，与致病菌进行营养竞争越激烈，可在一定程度上抑制根结线虫病害的发生，因而B3蜡样芽孢杆菌抗根结线虫病害的效果最佳。

从3 种芽孢杆菌对根结线虫的防控效果来看，3者均能不同程度地降低烟株根际土壤中根结线虫的虫口密度，同时降低根结线虫病害的发病率和病情指数。其中，根据计算的发病率和病情指数，B3、B9蜡样芽孢杆菌的效果要优于S2蕈状芽孢杆菌，且均以B3蜡样芽孢杆菌的效果最好，这可能与芽孢杆菌具有较强的抗菌活性，但不同种类的芽孢杆菌能不同程度抑制根结线虫的活性有关［20］。程万里等［21］、曾立等［22］的研究表明，多粘类芽孢杆菌 KM2501-1不仅能抑制番茄南方根结线虫活性，还能促进植物的生长发育。张文博等［23］也发现另外一种芽孢杆菌——贝莱斯芽孢杆菌FZB42 对防治松材线虫效果较好。

4 结论

3种芽孢杆菌（B3蜡样芽孢杆菌、B9蜡样芽孢杆菌和S2蕈状芽孢杆菌）均能增加土壤中细菌菌群的种类与部分有益菌群的相对丰度，不同芽孢杆菌对土壤的细菌菌群结构的影响不同。3种芽孢杆菌中，添加B3 蜡样芽孢杆菌后的根际土壤中细菌菌群最丰富，该菌可显著增加根际土壤中有益菌假单胞菌科（Pseudomonadaceae）的相对丰度，有效抑制烟株根结线虫病害的发生。3 种芽孢杆菌均可不同程度地降低烟株根结线虫病害的发病率和病情指数，其中，B3蜡样芽孢杆菌的效果最好。