兔膝骨性关节炎模型肠道菌群的16S rRNA检测分析△

梅其杰，徐文飞，延伟伟，袁长深，郭锦荣，黄西龙，曾 超，彭俊青

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200；3.华中科技大学同济医学院附属梨园医院，湖北 武汉 430077）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）是一种常见的老年性关节疾病，以反复关节疼痛、活动受限、软骨退变为主要特征［1］。据流行病学研究发现，65岁以上老年人KOA的发病率可达50%，随着人口老龄化的加重，KOA的发病率越来越高［2，3］，从而导致致残率及经济压力更加沉重，然而目前其发病机制尚未明确。有研究发现，KOA可能与肠道菌群（gut microbiota,GMB）的变化有关，虽然没有直接证据表明GMB是否通过免疫系统影响KOA的发生和发展，但两者有共同的危险因素，如饮食、年龄、肥胖、炎性疾病等［4-10］。作者的前期研究显示，GMB可能参与了KOA发病机制［11］，然而目前却尚无试验研究来进一步证实此观点，故本文拟通过对KOA兔进行肠道菌群基因测序，观察兔KOA模型与GMB变化的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年健康CV级日本大耳白兔20只（产地：南宁），体重2～3 kg，雌雄各半，由广西广得生物科技有限公司提供（许可证号:SCXK桂2017-0001)。按随机数字表法随机分成2组，KOA组12例，对照组8例，分别编号。

1.2 膝骨关节炎模型建立

兔子先在SPF级实验室适应3 d。将兔仰卧固定于兔台上，用剪刀剃掉右后腿膝关节周围毛发，露出皮肤，碘伏棉签消毒，轻轻弯曲右膝关节，自膝关节外侧膝眼进针，刺入关节腔内，先回抽，确定针头位于关节腔内后，KOA组于1、4、7 d注入含2%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，注射完后屈伸膝关节20次左右，以使所注射溶液能均匀浸润膝关节腔。对照组相同方法注射0.5 ml生理盐水。注射后每天驱使兔活动20 min。首次关节腔注射木瓜蛋白酶2周后即可以获得稳定的KOA模型。

1.3 样本采集与DNA提取

将兔KOA模型造模成功后，未做特殊药物干预，于第15 d早上，统一收集两组兔的粪便，将标本置于-80°C的干冰包装袋，按测序公司的要求，24 h转送至其实验室。采用二代16S rRNA测序技术对粪便样本进行检测。对所有采集的粪便样本，进行总DNA提取，并利用Nanodrop法进行定量检测，同时运用1.2%琼脂糖凝胶电泳试验鉴定提取质量。

1.4 DNA扩增

采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，以微生物核糖体RNA或特定基因片段为靶点，通过设计相应的引物并添加样本特异性Barcode序列，进而对rRNA基因可变区或特定基因片段进行PCR扩增。同时运用磁珠的吸附作用对扩增产物进行纯化回收，采用荧光试剂（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）对回收产物进行荧光定量，按照每个样本的测序量需求，对各样本进行相应比例的混合。

1.5 文库分析

采用美国Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，首先对上述扩增产物进行序列末端修复，通过试剂盒中的End Repair Mix 2切除DNA序列5’端的突出碱基，同时添加一个磷酸基团、补齐3’端的缺失碱基；在DNA序列的3’端添加A碱基以防止DNA片段自连，同时保证目标序列能与测序接头相连（测序接头3’端有一个突出的T碱基）；在序列5’端添加含有文库特异性标签（即Index序列）的测序接头，使DNA分子能被固定在Flow Cell上；采用BECKMAN AMPure XP Beads，通过磁珠筛选去除接头自连片段，纯化添加接头后的文库体系；对上述连上接头的DNA片段进行PCR扩增，从而富集测序文库模板，并采用BECKMAN AMPure XP Beads再次纯化文库富集产物；通过2%琼脂糖凝胶电泳，对文库做最终的片段选择与纯化。

1.6 DNA测序

上机测序前，先对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统对文库进行定量分析，筛选合格的文库；将合格的上机测序文库梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件对实验数据进行统计学处理，计量资料±s表示，组间均数对比采用独立样本t检验方法；计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本的差异性分析

本项目纳入的研究样本共20例，其中KOA组12例，对照组8例，结果显示，KOA组共含有20 188种物种（ASV/OTU），而对照组含有14 029种ASV/OTU，其中两者共有的ASV/OTU有3 924个，详见图1a。使用GraPhlAn工具，展示各ASV/OTU（样本总体中的）在进化树中的位置，并标出各分类单元。画出样本中相对丰度在0.01%以上的ASV/OTU，详见图1b。将两组菌群所含的物种进行比较，结果见表1，两组间在门、属水平的差异具有统计学意义（P＜0.05），KOA组在门、属水平上菌群均较对照组更为丰富；而在纲、目、科、种水平的差异无统计学意义（P＞0.05），说明KOA组在纲、目、科、种水平上菌群与对照组相当。

表1 KOA组与对照组物种分类（种，±s）与比较

表1 KOA组与对照组物种分类（种，±s）与比较

物种层级门纲目科属种K O A组1 0.9 2±0.9 0 1 9.0 8±2.2 3 2 6.6 7±3.4 2 4 2.7 5±6.5 1 5 4.7 5±7.2 3 2 5.8 3±3.9 5对照组9.8 8±0.6 4 1 7.8 8±1.4 6 2 4.7 5±3.1 5 4 0.0 0±6.5 1 4 8.8 8±3.4 0 2 8.1 3±2.2 3 P值0.0 0 7 0.1 6 1 0.2 1 6 0.2 1 3 0.0 4 7 0.1 1 6

此外，为深入研究韦恩图中的物种分类分布（各个区域）情况，ASV/OTU的数量使用柱状图表述，研究发现在门水平上：厚壁菌、拟杆菌的数量最多，在属水平上：瘤胃球菌属及颤螺菌属数量最多，详见图1c；而在各个区域的物种丰度组成上发现：厚壁菌、拟杆菌的物种丰度较广（门水平上）；同时发现瘤胃球菌属及多形杆状菌物种丰度广（属水平上），详见图1d。

图1 两组样本差异性分析图 1a:ASV/OTU的韦恩图 1b:含显著性分析的GraPhlAn进化树图 1c:韦恩图不同区域的ASV/OTU数目统计柱状图 1d:韦恩图不同区域的ASV/OTU丰度柱状图

2.2 物种组成热图

采用热图进行物种组成分析比较样本间的物种组成差异：将样本中平均丰度前50位的属的丰度数据绘制热图，发现OA组的物种组成较对照组的更加丰富，尤其在普雷沃菌属、不动杆菌属、厌氧菌属、绿脓杆菌属、劳森氏菌属等菌群。详见图2a。

2.3 LEfSe分析

LEfSe分析是一种常见的差异分析方法，不仅可以直接对所有分类水平同时进行差异分析，而且更加强调寻找分组之间稳健的差异物种，即标志物种（biomarker）。本研究发现KOA组的变形杆菌、α-变形菌、弧菌科等差异显著，其中变形杆菌为KOA组的GMB标志物种，详见图2b。

2.4 关联网络分析

基于微生物之间相互关系进行样本网络推断分析（network analysis）构建样本的关联网络图，其中每个点代表群落中的一个ASV/OTU；两个点之间的连接线代表所连接的两个点之间的正相关或负相关的分布趋势。研究发现KOA组与对照组均含有丰富的菌群，详见图2c。

2.5 代谢通路分析

利用KEGG数据库对样本从代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞进程、生物体系统和人类疾病6个方面进行二级功能通路丰度分析，发现菌群样本主要与代谢通路密切相关，其中在碳水化合物代谢、氨基酸代谢及辅助因子和维生素代谢上极为突出；详见图2d。

图2 物种组成等分析 2a:物种聚类的属水平物种组成热图 2b:标志物种的LDA效应值柱状图 2c:关联网络图 2d:预测的KEGG二级功能通路丰度图

3 讨论

众所周知，在人类肠道中存在的大量微生物菌落对人类健康起到至关重要的调节作用。GMB不仅对消化系统产生影响，而且能调节机体的代谢、免疫、炎症状态［12，13］。有研究显示，通过利于运动对GMB的重塑作用及对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）及Toll样受体4（toll-like receptor4,TLR4）信号通路的调控，因LPS能激活TLR4受体蛋白及下游蛋白NF-κB这两条途径［14］。另外，研究表明GMB在痛风性关节炎的发病机制扮演了重要角色，可能因其能够抑制抑炎因子的释放，以及促进促炎因子的释放［15］。同时，有研究通过探讨GMB、肠道微环境、脑肠轴、代谢免疫与骨关节炎的关系，发现GMB影响中药的疗效，中药可影响GMB平衡，且证实GMB与骨关节炎密切相关［16］。

但是，GMB中哪些菌属在KOA起作用呢？本研究门、属水平发现：KOA组在门、属水平上菌群均较对照组丰富；在纲、目、科、种水平发现：KOA组在纲、目、科、种水平上菌群与对照组相当。进一步研究发现，在门水平上：厚壁菌、拟杆菌的数量最多；在属水平上：瘤胃球菌属及颤螺菌属数量最多；在ASV/OTU丰度图上，结果亦是如此。同时，OA组的标志物种为变形杆菌。这一结果与大多数的研究类似［17～21］。因此，作者认为肠道菌群中的变形杆菌有可能成为研究KOA的标志物。

另外，作者前期的研究发现miRNA在KOA发生发展中的作用明显。而外泌体在OA的深入研究，亦为OA软骨再生提供了新思路［22］。已有学者在miRNA-21-/-小鼠模型上，发现miRNA具有正向或负向调控肠道的免疫调节功能和屏障功能，从而起到重要调节作用［23，24］；另外，还发现 GMB也可作为miRNA和宿主之间的桥梁。因其可通过改变miRNA的表达水平进而与宿主相互作用。那么，解析miRNA与GMB相互作用的机制，将在KOA发病机制上提供新的思路和方法。

GMB和宿主关系为相互影响，可视为两者之间的动态平衡。GMB对人体代谢与免疫系统影响，体现在健康状态及疾病的发生发展中；而机体的行为（生活方式、饮食、运动习惯等）又反作用影响GMB，导致GMB的多样性。虽然，当前已有许多研究发现了某些疾病伴随着肠道菌群的改变而改变，且肠道菌群发生变化也会影响疾病的发展进程及其转归；但是，研究均未能阐明其中的因果关系。Xu等［25］在对亚洲人群的肠道菌群研究后，发现微生物与疾病，并不能简单定义谁是因谁是果。在不同的复杂疾病中，肠道菌群时而为因，时而为果，需要个案分析。

就目前而言，对肠道菌群的具体结构和功能及其影响因素和作用机制的深入研究仍将是未来肠道菌群研究的重点方向。本研究为实验兔的研究，与大多数的研究（无菌小鼠为实验对象）一样，仅仅是一种病态的动物模型，其结果能否适用于临床还是未知的，为此，本研究团队将在下一阶段对KOA人体的肠道菌群菌落分布、物种丰度以及肠道菌群代谢产物进行研究，为肠道菌群相关疾病的发生机制及其原理提供新思路、新方法。