基于衍生化GC-MS法分析不同栽培基质对铁皮石斛代谢的影响

左思敏 付家顺 余海东 云永欢

摘  要：栽培基质是影响铁皮石斛生长的主要因素之一，本研究拟选用松树皮（PB）、椰糠（CC）和松树皮∶椰糠（PC，1∶1）的复合基质栽培铁皮石斛，基于代谢组学思路探究栽培基质对铁皮石斛茎生长代谢的影响。通过环刀法测定3种基质的物理性质，利用苯酚-硫酸比色法测定铁皮石斛茎的多糖含量，采用硅烷化衍生化法结合气相色谱-质谱法检测铁皮石斛茎中的初级代谢产物。结果表明，椰糠和复合基质的通气孔隙度、持水性能均优于松树皮基质，多糖含量顺序为椰糠组>复合基质组>松树皮组。采用主成分分析（principle component analysis，， PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，， OPLS-DA）对检测鉴定出的42个代谢产物进行多元统计分析，结果显示，不同基质栽培的铁皮石斛样本各自聚成一类，组间分离明显，说明各组间代谢产物差异显著。进而基于OPLS- DA结果获得的变量重要性投影值（variable importance in project，， VIP）结合差异倍数值（fold change，， FC），设置阈值条件为VIP>1、FC≥2或FC≤0.5，在松树皮与复合基质、松树皮与椰糠、复合基质与椰糠组间分别筛选出显著性差异代谢物14、11、5个。与椰糠组和复合基质组相比，大部分差异显著的代谢物含量在松树皮组中呈下调趋势。基质物理性质与差异代谢物联合分析结果表明，栽培基质的通气供水能力越弱，植株可利用水越少，景天酸代谢途径表达越强而C途徑越弱，糖类物质积累量越少。即通气孔隙度高、持水性能好的基质更有利于铁皮石斛的糖类物质的积累。本研究结果可为铁皮石斛栽培提供基础数据和理论指导。

关键词：栽培基质;铁皮石斛;气相色谱-质谱法（GC-MS）;代谢产物中图分类号：S567.239      文献标识码：A

Effect on Metabolites of by Different Cultivation Substrates Based on Derivative GC-MS Method

ZUO Simin， FU Jiashun， YU Haidong， YUN Yonghuan

1. School of Food Science and Engineering， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Environment and Plant Protection， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Cultivation substrate is one of the main factors affecting the growth of . In this study，

the substrates of pine bark （PB）， coconut coir （CC） and the mixture of pine bark∶coconut coir in a 1∶1 ratio （PC） were used to plant . On the basis of metabolomics， the effects of the properties of the three cultivation substrates

on the metabolism of stems were investigated. Cutting ring method was used to determine the physical properties of the three cultivation substrates， phenol-sulphuric acid method was used to detect the content of polysaccharides， and gas chromatography mass spectrometry （GC-MS） method was performed to detect the primary metabolites. The results indicated that the aeration porosity and water holding capacity in the group of coconut coir and complex substrate were higher than that of the substrate of pine bark， the content of polysaccharides were ranked as coconut coir > complex substrate > pine bark. Principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） for multivariate statistical analysis of 42 identified metabolites showed that the samples cultivated in different substrates clustered into one group， and the separation between groups was obvious， indicating the metabolites of the samples from different groups existed a significant difference. Combined with fold change （FC）， the VIP values calculated based on the OPLS-DA model were used to screen the metabolites with significant difference. When the conditions （VIP>1 and FC≥2 or FC≤0.5） were set， there were a total of fourteen， eleven and five metabolites， with significant differences in content across groups being screened in the comparison of pine bark and complex substrate， pine bark and coconut coir， complex substrate and coconut coir， respectively. A large part of metabolites with significant difference in the group of coconut coir and complex substrate performed a lower accumulation in the pine bark group. The results gained by combined analysis between the physical properties of the three cultivation substrates and the metabolites with significant difference revealed that if the cultivation substrate had the weaker aeration and capacity of water supply， there would be a stronger expression in crassulacean acid metabolism （CAM）. Thus， C pathway would become weaker， and carbohydrates accumulate less. In other words， the substrate with the properties of high aeration porosity and good water holding capacity was beneficial to the accumulation of carbohydrate in . Therefore， this study could provide data and theoretical guidance for the cultivation of .

cultivation substrate; ; gas chromatography mass spectrometry （GC-MS）; metabolites

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.023

铁皮石斛（）是兰科石斛属的名贵中草药植物，素有“中华九大仙草之首”之美誉，富含多糖、生物碱、氨基酸、黄酮等活性成分，具有增强机体免疫力、抗衰老、降血糖血脂等功效。野生铁皮石斛因生长条件苛刻且生长缓慢而导致资源匮乏，为满足市场需求，学者们致力于研究开发研究人工栽培方法，以代替野生资源。栽培基质是铁皮石斛生长的必要条件，选择合适的栽培基质对于大规模培育高产优质的铁皮石斛具有重大意义。铁皮石斛是附生植物，喜好温暖、潮湿、通风透气的环境，常附生于树干、石头上。因此，在筛选铁皮石斛人工栽培的基质时，需综合考虑基质的松散程度、通气性、持水性等物理性质。经过多年探索研究，目前常用于铁皮石斛人工栽培的基质有松树皮、椰糠、泥炭、水苔等。松树皮质地疏松，具有空隙量大，透水透气性好的优点，非常适合铁皮石斛生长。翟明恬等、谢静等的研究表明，与泥炭土混合物、椰糠、谷壳、腐殖土等基质相比，松树皮栽培的铁皮石斛在成活率、萌芽数、株高等方面表现良好，是适合铁皮石斛人工栽培的优良基质。椰糠具有较好的保水保肥性能，在海南资源丰富，取材便利，是栽培铁皮石斛的优良基质。

在栽培基质的比较评价研究中，多以铁皮石斛的移栽成活率、生长指标为评价标准，但这仅能说明铁皮石斛的产量而无法表征其质量。质量的评价上更多的是依靠某种或多种有效成分指标，如多糖、黄酮等成分的含量。然而，铁皮石斛作为一种药用植物，讲究“君臣佐使，方剂配伍”的使用原则，其药效是多种化学成分共同作用的结果。

代谢组学是基于气相色谱质谱法（gas chro­matography mass spectrometry，， GC-MS）、液相色谱质谱法（liquid chromatography mass spectro­metry，， LC-MS）或核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，， NMR）技术分析生物体内内源性代谢产物及其变化规律的一门科学，广泛应用于药用植物领域，如药用植物真伪鉴别、产地溯源等。基于GC-MS研究铁皮石斛代谢谱有助于更全面地了解铁皮石斛的代谢变化情况，从而探究基质对铁皮石斛代谢的影响。

本研究选取松树皮、椰糠、松树皮∶椰糠（1∶1）的复合基质等3种基质栽培铁皮石斛，测定3组基质的物理性质指标，采摘2年生的鐵皮石斛，测定石斛茎中的多糖含量，并采用硅烷化衍生化法结合GC-MS法检测铁皮石斛茎中的初级代谢产物，基于代谢组学分析思路筛选差异显著的代谢物。将基质的物理指标与铁皮石斛茎中差异显著的代谢物含量进行联合分析，探究不同栽培基质对铁皮石斛代谢成分的影响机理，为铁皮石斛栽培基质的选择提供理论指导和基础数据。

  材料与方法

  材料

经考察，选择海南省海口市秀英区药谷工业园作为铁皮石斛栽培基地，利用大棚进行规范种植，并采用14.2 cm×10.2 cm×10.3 cm的多孔透气网盆进行盆栽试验，选定栽培基质为松树皮（粒径为10～13 mm，PB）、椰糠（粒径为14～18 mm，CC）、松树皮∶椰糠（1∶1，PC）的复合基质。试验于2017年11月实施，栽培基质经杀菌和水浸泡处理后，装入盆中约三分之二体积处，每盆栽种1株浙江乐清品种铁皮石斛幼苗。并在幼苗移栽1个月后施加1‰的磷酸二氢钾。试验按不同基质设3个处理，每个处理6个单元，每个单元包含9盆，共162盆。置于大棚的育苗活动床上，该大棚具有遮阳、喷灌设施，定时定期对植株进行浇水，浇水频率为春冬季节2 d一次，夏秋季1 d一次。夏秋进行适当遮阴，降温通风，并及时对石斛的生长环境进行监测检测。于2019年11月采收，取铁皮石斛茎条部位，立即放入液氮罐冷冻，采样完毕后转移至–80℃冰箱保存。

试剂：N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，98%）、甲氧氨基盐酸盐（98%）、阿东糖醇（99%），购于上海麦克林生化科技有限公司;吡啶（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、氯仿（色谱纯），购于LabServ公司;D-（+）-葡萄糖标准品、苯酚（分析纯）、浓硫酸（分析纯），购于西陇化工股份有限公司。

仪器与设备：5804R高速冷冻离心机（Eeppendorf中国有限公司）;UV-5500PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）;KQ- 400KDE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;7890B/7000C GC-MS联用仪[（安捷伦科技（中国）有限公司]）;HP-5MS色谱柱（30 m× 250 μm×0.25 μm）[（沃特世科技（上海）有限公司]）。

  方法

1.2.1  基质物理性质的测定  基质物理性质测定。采用环刀法测定基质的容重、持水能力、总孔隙度、通气孔隙度、持水孔隙度、气水比。具体测定过程参照齐海鹰等的方法。

1.2.2  粗多糖提取及含量的测定  取铁皮石斛粉末于100 mL离心管，按料液比1∶120（/）加蒸馏水，混匀，50℃下超声（超声功率为240 Ww）2.0 h。超声结束后立即过滤，取少量蒸馏水分次洗涤滤渣，合并滤液。将滤液转移至100 mL容量瓶中定容，精密量取5 mL于50 mL离心管中，精密加入25 mL无水乙醇，摇匀，4℃冷藏至少4 h，取出，离心（10 000 r/min，20 min），弃上清液，取20 mL 80%乙醇洗涤沉淀，8000 r/min离心15 min，洗涤2次。弃去上清液，所得沉淀即为粗多糖，挥干溶剂后加水溶解并定容至50 mL。使用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，试验平行3次。

1.2.3  样品提取及衍生化处理  样品处理参照LISEC等的方法并进行适当调整。取新鲜铁皮石斛茎条剪成约5 mm的小段，加入液氮研磨至粉末状，迅速称取（100±5）mg于10 mL离心管中，并立即加入1.4 mL在–20℃预冷的甲醇，涡旋1 min。向离心管中加60 μL阿东糖醇溶液（0.2 mg/mL）作为内标，涡旋30 s，随后在40℃下超声提取30 min。超声结束后在样液中依次加入750 μL氯仿和1.4 mL预冷（4℃）的超纯水，涡旋1 min，以8000 r/min的转速离心15 min。精密吸取2.0 mL上清液至5 mL离心管中。将等质量的不同基质栽培的铁皮石斛粉末充分混匀，称取（100±5）mg作相同处理作为质控样本。

将提取液放入氮吹仪中进行氮吹挥干溶剂，加入120 μL甲氧基胺盐酸盐溶液（20 mg/mL）涡旋30 s，并在37℃下保温反应120 min;再加入120 μL衍生化試剂BSTFA，在25℃下保温90 min。吸取试液转移至进样小瓶中，4℃保存并在48 h内检测。

1.2.4  GC-MS条件  进样量：1 μL;分流比为20∶1;流量：1 mL/min;升温程序：初始温度设为40℃，运行5 min后以10℃/min的升温速率升温至280℃，保持5 min;进样口温度：280℃;传输线温度：280℃。电离方式：EI;电子能量：70 eV;离子源温度：300℃;扫描方式：SCAN，扫描质量范围为35～780;MS在9.5～34 min时间段内采集数据。

  数据处理

通过SPSS 23.0软件使用Duncan’s多重比较检验差异显著性。GC-MS数据经自动解卷积、峰提取、峰对齐等处理后，通过NIST14.0标准质谱图库数据系统对信号进行鉴定，并对缺失值进行平均值填充，得到一个代谢物数据矩阵。采用SIMCA-P14.1对数据矩阵进行主成分分析（principle component analysis，， PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant，， OPLS-DA），根据fold change（FC）值和OPLS-DA中的VIP值筛选显著性差异代谢物。

  结果与分析

  栽培基质物理性质

基质的各项物理性质结果如表1所示。持水能力和通气孔隙度分别表示基质对水分保持能力的大小和基质与空气交换能力的大小，由表中数据可以看出，松树皮基质的持水能力和通气孔隙度明显弱于椰糠和复合基质，而松树皮基质的容重高于椰糠和复合基质，表明该基质对植株的固定能力更强。

  栽培基质对铁皮石斛茎多糖含量的影响

通过SPSS 23.0软件使用Duncan’s多重比较对不同组多糖含量进行分析，结果如表2所示。3种不同基质栽培的铁皮石斛茎多糖具有显著差异，其中椰糠栽培的铁皮石斛多糖含量最高，为30.53%;松树皮栽培的铁皮石斛茎多糖含量最低，仅13.45%。

  不同基质栽培的铁皮石斛代谢谱

铁皮石斛样品经GC-MS检测，总离子流图见图1。对色谱图进行自动解卷积和积分处理，得到196个峰，借助NIST14.0标准质谱图库数据系统检索相关质谱信息，共鉴定出42个匹配度大于70%的化合物，主要为糖和糖苷类物质（16个）、有机酸（13个）。以峰面积计算各物质的相对百分含量，得到3种基质栽培的铁皮石斛代谢谱信息如表3所示。其中，苹果酸峰面积占比最高，在松树皮组、椰糠组、复合基质组中分别为34.32%、31.73%、32.36%。而松树皮组、椰糠组、复合基质组中糖和糖苷类物质含量占比分别为41.96%、51.94%、43.83%，有机酸物质占比分别为50.18%、44.49%、49.35%。

  多元统计分析

采用多元统计分析方法对高维数据矩阵进行简化和降维。对数据进行自标尺化处理，采用无监督的主成分分析方法，以明确不同基质栽培的铁皮石斛样品组间和组内的相似性和差异性，结果如图2所示，质控样本很好地聚集在一起，这表明仪器稳定性好。第一主成分为50.4%，第二主成分为14.1%。松树皮、椰糠、复合基质3组样本各自聚为一类，表明样本的组内差异较小;不同组样本在第一和第二主成分上均有明显分离，说明样本的组间差异较大。其中松树皮组与椰糠组样本相距最远，复合基质组样本分布在松树皮、椰糠2组样本之间，这一差异趋势与基质物理性质结果相对应，表明栽培基质对铁皮石斛初级代谢产物有较大的影响。

采用有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）方法分别对松树皮、椰糠、复合基质3组作进一步分析，以最大程度地提取组间差异信息，得分图如图3A、图3C、图3E所示，松树皮、椰糠、复合基质3组样本间均有显著差异，说明不同基质栽培的铁皮石斛存在明显的代谢差异。所建立的OPLS-DA模型RY值和Q值均大于0.9，表明模型可以很好地解释数据矩阵信息，有较好的预测能力。对OPLS-DA模型进行200次置换检验，以验证模型是否存在过拟合，结果如图3B、图3D、图3F所示。所有R和Q左边的点都低于右边的点，且R和Q的回归线斜率都为正，说明建立的OPLS-DA模型具有可行性， 可根据建立模型所得到的VIP值筛选松树皮-椰糠、松树皮-复合基质、椰糠-复合基质3组之间的差异代谢物。

  差异代谢物筛选

基于OPLS-DA结果获得变量重要性投影（variable importance in project，， VIP），结合差异倍数（fold change，， FC），筛选差异显著的代谢物。设置阈值条件为VIP>1、FC≥2或FC≤0.5。松树皮组与复合基质组间筛选出14个差异显著的代谢物，松树皮组与椰糠组间11个，复合基质组与椰糠组间5个，共筛选到17种差异显著的代谢物，占检测出的所有代谢物（42种）的40.5%，结果如表4所示。与复合基质组相比，在松树皮组中12个代谢物（糖和糖苷类7个，有机酸类3个，氨基酸及其衍生物类1个，胺和酰胺类1个）含量显著下调，β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖、β-D-（+）-塔罗糖、甲基半乳糖苷、L-（-）-山梨糖、L-苏阿糖酸、2-酮-1-葡萄糖酸、章胺、4-氨基丁酸等物质下调了3倍以上。其中，章胺和4-氨基丁酸在松树皮组中未检出。与椰糠组相比，在松树皮组中10个代谢物（糖和糖苷类5个，有机[酸类2个，

氨基酸及其衍生物类1个，胺和酰胺类2个）显著下调，α-D-葡萄糖、β-D-（+）-塔罗糖、甲基半乳糖苷、L-（-）-山梨糖、章胺、4-氨基丁酸等物质下调了3倍以上。椰糠组与复合基质组相比，仅L-5-羟脯氨酸、L-苏阿糖酸、β-D-（+）-塔罗糖、4-氨基丁酸、对羟基苯丙酸5个代谢物含量表达差异显著。这表明，复合基质、椰糠基质栽培的铁皮石斛糖和糖苷类及有机酸类物质显著高于松树皮组，复合基质组与椰糠组之间则存在较小的差异，且复合基质组铁皮石斛略优于椰糠组。

  讨论

栽培基质的主要功能是固定植物，调节供氧、供水。不同栽培基质物理性质不同，供氧供水能力也就不一致。由表1可以看出，基质容重从大到小排序为：松树皮>松树皮与椰糠复合基质>椰糠。通气孔隙度及持水能力排序为：椰糠>松树皮与椰糠复合基质>松树皮。这表明松树皮、椰糠基质对铁皮石斛植株的固定能力强于复合基质;椰糠、复合基质对铁皮石斛植株的供水能力强于松树皮。以传统检测方法检测铁皮石斛茎中的多糖含量，结果表明，3组铁皮石斛茎多糖含量从高到低排序为椰糠组>复合基质组>松树皮组。多糖含量越高，铁皮石斛质量越好，即椰糠基质栽培的铁皮石斛质量最优，复合基质次之，松树皮基质最差。为进一步探究栽培基质对铁皮石斛的影响，采用基于代谢组学思路的GC-MS方法检测比较3种基质栽培的铁皮石斛茎中的初级代谢物。

通过多元统计分析共筛选出17个差异显著的代谢物，与松树皮组相比，在复合基质组、椰糠组中葡萄糖、麦芽糖、半乳糖等可溶性糖及莽草酸等有机酸含量显著上调。代谢谱结果表明，有机酸类物质总含量从高到低排序为：松树皮>复合基质>椰糠，糖和糖苷类物质总含量排序为椰糠>复合基质>松树皮。这表明基质通气孔隙度及持水能力较高时更有利于铁皮石斛中糖类物质的积累。这与杨霞等关于腐熟菌渣对石斛的影响研究结果一致，较高的栽培基质持水孔隙度、容重、总孔隙度会对石斛植株的物质积累、根系延伸和分裂、植株的健康造成不同程度的抑制作用，而较高的通气孔隙度可以显著促进石斛的物质积累和根系发育。这一结果可能与铁皮石斛的光合特性有关。

据文献报道，铁皮石斛是兼性景天酸代谢（crassulacean acid metabolism，， CAM）植物，可以在夜间吸收同化CO，以苹果酸形式储存，并在白天分解有机酸释放CO，通過卡尔文循环合成糖类。在非生物胁迫环境下，铁皮石斛中C和CAM并存，缺水情况下会因栽培基质含水量的变化执行不同强度的CAM途径。SHAMEER等的研究表明，CAM植物的光合效率低于C和C植物，干物质年积累量较低。采收前一段时间，浇水频率变更为2 d一次，但生长环境依然保持高温干燥状态，栽培基质水分会迅速流失，且松树皮基质因其持水性能低于椰糠、复合基质，水分流失更快。在该环境下，铁皮石斛植株极有可能出现短暂性的缺水，从而诱导CAM的表达增强。气质分析结果可以证实这一猜测，松树皮、复合基质、椰糠3组中检出的苹果酸峰面积占比分别为34.32%、31.73%、32.36%，而苹果酸是调节石斛属植物C/CAM代谢转换的标志性物质。故而推测铁皮石斛在栽培期间CAM途径有较强的表达。且由于松树皮基质持水性能弱于复合基质和、椰糠，松树皮比较另外2种基质更容易缺水，从而导致松树皮基质栽培的铁皮石斛中CAM表达强于另外2组。因此，糖和糖苷类及有机酸类物质在松树皮与复合基质和松树皮与椰糠两对比较组间表达差异显著，且CAM表达较强的松树皮组铁皮石斛多糖积累量少于复合基质和椰糠。值得一提的是，本研究是基于单位质量的铁皮石斛茎展开的，未对单位面积的铁皮石斛总重量进行测定，旨在讨论单位质量的铁皮石斛茎中代谢物含量变化，侧重点在于“优质”的铁皮石斛。在生产试验中，如考虑生产效率还需结合总生物量来分析，以栽培出“优质”且“高产”的铁皮石斛。

  结论

本文以松树皮、椰糠、松树皮∶椰糠（1∶1）的复合基质3种栽培基质栽培的铁皮石斛茎为研究对象。通过环刀法测定了3种基质的物理性质，结果显示复合基质、椰糠的通气孔隙度、持水性能优于松树皮基质。使用苯酚硫酸法检测铁皮石斛茎中的多糖含量，结果表明椰糠基质栽培的铁皮石斛多糖含量最高，质量最好，松树皮组含量最低，质量最差。采用GC-MS方法检测铁皮石斛茎中的初级代谢产物，共鉴定出42个物质。以VIP>1、FC≥2或FC≤0.5为条件，筛选出17个差异显著的代谢物，主要为糖和糖苷类、有机酸类物质。与松树皮组相比，大部分差异显著的代谢物在复合基质、椰糠中有较高的积累量。基质物理性质与差异代谢物联合分析结果表明，栽培基质通气供水能力越弱，植株可利用水越少，CAM途径表达越强而C途径则弱，糖类物质积累量越少。即通气孔隙度高、持水性能好的基质更有利于铁皮石斛糖类物质的积累。

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