微卫星不稳定性检测在结直肠外科的应用及其临床意义

蒋松松，陈刚

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是多种癌基因突变或抑癌基因失活、累积导致基因组不稳定的结果。基因组不稳定主要有微卫星高度不稳定(high microsatellite instability,MSI-H，15%)和染色体不稳定(85%)两种途径。MSI-H发生的原因有两种：①错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6或PMS2发生胚系突变，即林奇综合征(lynch syndrome，LS)，属遗传性疾病，约占3%～5%；②MLH1基因启动子超甲基化，散发的MSI-H结直肠癌几乎都属于这种情况，约占12%～15%[1]。

MSI-H表型最早在遗传性结直肠癌中被发现，后来发现MSI-H肿瘤可发生于多个部位，MSI-H是泛癌种肿瘤标志物，在结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌、小肠腺癌、卵巢癌、肝胆肿瘤等中都有不可忽视的发生率。

国内每年新增的MSI-H肿瘤患者数量高达32.4万例，平均每天新增888例。以MSI-H作为区分肿瘤类型的生物标志物，能找出数量庞大的同类型患者；这些患者通常具有相似的临床病理、分子病理特征，可以帮助医生制定、优化针对MSI-H型肿瘤患者的完整治疗方案[2]。2017年美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准程序性死亡受体1(PD-1)单抗-帕博利珠单抗(Pembrolizumab，商品名：Keytruda，K药)用于治疗错配修复基因功能缺陷(mismatch repair deficiency，dMMR)/MSI-H型不可切除或转移性经治的实体瘤患者。这是全球首个直接根据生物标志物划定适应证的“不看部位看标志物”的泛癌种抗肿瘤药物。

1 概述

微卫星(microsatellite，MS)是指分布在人类基因组中的短串联重复序列(1～6个或更多核苷酸，重复10～60次)，约占人类基因的10%。因其核心单元重复次数差异，在人群中表现出高度多态性；微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)是微卫星序列的长度因重复单位的插入或缺失而改变，进而形成新的微卫星等位基因的现象，是肿瘤第5种突变类型，常因dMMR引起；MMR基因可维持基因组的稳定性，降低自发性突变。MSI本质上是微卫星位点的长度改变，是MMR基因缺陷的主要分子表现[3]。

1993年，3个实验室同时发现的“MSI”现象，并证实这是由于DNA dMMR所引起。当时学术界对MSI并没有明确的界定标准，人们会用任何他们感兴趣的位点对肿瘤样本进行MSI检测，因此结果也比较混乱。1997年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)主办的第一次MSI研讨会在马里兰州的贝塞斯达(Bethesda)举行，首次给出了MSI的标准化定义：“与正常组织相比，肿瘤组织微卫星位点中重复单元的插入或删除导致的长度变化”。并推荐了一组MSI检测基因组合(2B3D Panel)，即后来为大家熟知的Bethesda Panel(或NCI Panel)。

目前已发现人类的MMR系统含有9种错配修复基因，其中主要是MLH1、MSH2、MSH6和PMS2这4种，又以MLH1和MSH2功能最为重要；MMR系统一旦出现问题，基因在复制过程中产生的错误会不断累积，这些错误往往就是癌症产生的元凶。产生MSI的主要原因就是MMR系统错配修复功能缺陷[4]。

2 MSI的检测

2021年结直肠癌分子标志物临床检测中国专家共识中指出，MSI检测的金标准是聚合酶链反应+毛细管电泳(PCR+CE)。推荐采用2B3D 的NCI Panel，检测5个位点(BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123、D17S250)。有两个及以上位点不稳定则定义为微卫星高度不稳定(MIS-H)，一个位点不稳定为微卫星低度不稳定(MSI-L)，没有位点不稳定为微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)[5]。

二代测序(next generation sequencing，NGS)是近年来出现的先进检测方法，优点是通量大，灵敏度高，采用NGS Panel一次性可检测上千个位点。但NGS生信分析更为复杂，进入临床还需要更多的数据积累和验证。

dMMR的临床意义等同于MSI-H，主要通过免疫组织化学方法(IHC)检测4种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)的表达水平，明确是否存在MMR功能缺陷(dMMR)[6]。但在某些病例中并不能同时检测到dMMR和MSI-H。例如，MSH6突变导致的dMMR引起MSI-H概率较低，可能达不到诊断MSI-H的标准；而MSI-H阳性的肿瘤偶尔也来自于迄今未发现的MMR通路蛋白。虽然二者检测一致率很高，临床上也经常混为一谈，但并不能划等号。

所以目前根据指南建议临床上MMR蛋白与MSI应共同检测，以提高诊断准确率，但是因检测的MMR通路蛋白少、检测位点少，仍然会存在漏诊；但随着NGS的逐步开展，经过更多的数据积累和验证，将来可能成为一种更准确的检测方式。同时国内也有学者尝试将结直肠癌患者染色体形态特征与深度学习人工智能的方法结合起来，通过人工智能的深度学习算法，有效识别出染色体特征，以此来判断患者MMR状态；所以探索新的MMR通路蛋白、MSI检测位点及新的检测方式尤为重要。

3 MSI检测在结直肠外科的应用及其临床意义

3.1 判断预后

3.1.1 MSI-H的CRC患者预后更好 Popat[7]等的一项研究，纳入了32个中心、共7 642例结直肠癌患者。分析结果显示：与MSS型相比，MSI-H的CRC患者预后更好，风险比(hazard ratio HR)=0.65(95%CI:0.59-0.71)，风险降低高达35%。

MSI-H对CRC患者预后的判断价值取决于分期。MSI-H是Ⅱ期CRC患者预后良好的指标，5年总生存期(overall survival，OS)和无病生存期(disease-free survival，DFS)均显著高于MSI-L和MSS的患者。病死率更低，且不容易发生肿瘤复发及淋巴结转移。

MSI-H也是N1期结肠癌预后良好的因素，接受氟尿嘧啶类(FP)+奥沙利铂(OX)治疗的患者中，MSI-H的N1组患者较MSS患者有更好的OS(HR=0.66；95%CI:0.46～0.95)；MSI-H对N2期结肠癌的预后无影响，与MSS患者比较，生存情况相似(HR=1.13；95%CI:0.86～1.48)[8]；

3.1.2 早发性结直肠癌(early onset colorectal cancer,EOCRC)患者MSI-H表型更多见 近期一项研究表明，20～39岁的美国年轻人患晚期EOCRC，指50岁前确诊的结直肠癌病例的人数急剧增长。研究人员分析了103 975例结直肠腺癌患者的数据，对比2000年至2002年和2014年至2016年间的数据，患晚期直肠腺癌的20～29岁年轻人增加了133%；30～39岁的患者增幅为97%，40～49岁的患者增幅为48%。20～29岁的直肠癌末期病例从18%急升到了31%，30～39岁的直肠癌末期病例也从20%增加到了29%。所以，年轻人被诊断出患有晚期结直肠癌的比例正逐步升高，且情况比以往任何时候都要严峻[9]。

研究还发现，与一般结直肠癌患者相比，早发性结直肠癌患者的MSI-H/dMMR频率更高，KRAS、BRAF均为野生型的比例更高，BRAF V600E型突变少见，表明EOCRC患者LS的发生率更高[10-11]。

3.1.3 结直肠癌可以用MSI状态作为分子分型的依据 2015年国际结直肠癌分型联盟提出了结直肠癌分子分型系统(consensus molecular subtype，CMS)，将结直肠癌分为5种CMS分子分型。①CMS 1(免疫型)占比14%，MSI-H，高频BRAF突变，伴强免疫活化，低度CIN，总生存和无复发生存均较好，但一旦复发，预后非常差；②CMS 2(经典型)占比37%，MSS，高频TP53突变，上皮样，高度CIN，伴显著的WNT和WYC信号通路活化，总生存和无复发生存均较好，复发后的预后相对较好；③CMS 3(代谢型)占比13%，MSI-H，高频KRAS突变，上皮样，中度CIN，伴有显著的代谢失调，总生存和无复发生存均较好；④CMS 4(间质型)占比23%，MSS，高频TP53突变，高度CIN，伴有显著的转化因子β异常活化、间质浸润和血管生成，总生存和无复发生存均很差。最后有13%的病例不能单独归为上述任何一类，成为混合型。目前基因测序并未普及至常规应用，所以CMS分子分型自提出之后，一直未能应用至临床实践中[12]。

3.1.4 MSI-H结直肠癌的临床病理及分子特征

与驱动基因突变相比，MSI-H在结直肠癌中的发生率非常高，约13%～20%。MSI-H最常见于Ⅱ期结直肠癌患者中；好发于近端结肠(右半结肠)，分化程度差，常伴有黏液成分，但较少转移倾向；多见于KRAS野生型、BRAF突变型、PIK3CA突变型及高肿瘤突变负荷(TMB-H)。存在特定通路MMR、WNT、PI3K和NOTCH基因突变富集；T细胞浸润多见；高免疫原性；CpG岛甲基化程度高[3]。

综上所述，MSI-H的CRC患者预后更好，OS和DFS均显著高于MSI-L和MSS的患者；早发性CRC患者的MSI-H/dMMR频率更高，MSI-H最常见于Ⅱ期结直肠癌患者中；好发于近端结肠(右半结肠)，分化程度差，常伴有黏液成分，但较少转移倾向。所以临床上对于年轻的CRC患者，尤其是右半结肠癌患者，更应该重视MSI的检测。

3.2 指导治疗

3.2.1 化疗 大量研究显示，MSI-H的结直肠癌患者无法从5氟尿嘧啶(5-FU)单药辅助化疗中获益；Ⅱ期 MSI-H的CRC患者，接受辅助化疗较未经治疗者，5年生存率反而显著缩短(71%vs.88%)；Ⅱ期MSI-H的CRC患者不受益于5-FU方案，但仍然有更好的预后[13]。

MSI-H的结直肠癌患者会对顺铂、卡培他滨及5-FU产生耐药性。MSI-H的CRC患者比MSS患者对伊立替康的治疗更为敏感；也有研究显示氟尿嘧啶类(FP)+奥沙利铂(OX)能够显著改善Ⅲ期结肠癌MSI-H患者的OS，并推荐此方案作为Ⅲ期MSI-H结肠癌患者的标准治疗手段[14]。

3.2.2 靶向治疗 CALGB/SWAOG 80405 研究发现MSI-H患者可以从贝伐珠单抗，而非西妥昔单抗中获益，接受贝伐珠单抗比西妥昔单抗治疗死亡风险降低87%。

3.2.3 免疫治疗 因MSI-H所致移码突变产生的移码肽具有高度免疫原性，对PD-1/PD-L1抑制剂均反应良好；2015年Le等[15]发表在《新英格兰杂志》的文章，证实肿瘤的MSI状态与免疫治疗效果密切相关；Keynote-164研究[16]证实，免疫治疗对于经治的MSI-H/dMMR mCRC患者能带来持久的临床获益，拖尾效应显著。由美国安德森癌症中心牵头8个国家31个中心开展的CheckMate-142研究[17]证实：MSI-H的mCRC患者后线治疗，纳武利尤单抗(O药)+伊匹木单抗(Y药)联合治疗比O药单药能获得更好的无进展生存期(progression free survival，PFS)和OS；Keynote-177研究证实，MSI-H的mCRC患者，随机接受帕博利珠单抗(K药)或化疗，两组中位PFS分别是16.5个月和8.2个月，差异具有统计学意义。基于此研究结果，FDA批准K药作为一线治疗MSI-H的不可切除或转移性结直肠癌患者。CheckMate-142研究[18]证实，O药+Y药一线治疗MSI-H/dMMR转移性结直肠癌效果出色，展现出显著的长拖尾效应，且既往治疗越少，免疫治疗效果越好，表明免疫治疗用于更早的治疗线数会获得更高的获益。

2021更新的NCCN结直肠癌指南，新增了纳武利尤单抗(O药)±伊匹木单抗(Y药)或帕博利珠单抗(K药)用于MSI-H/dMMR晚期患者一线治疗方案；同年中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会(Clinical Oncology Collaborative Committee of China Anti Cancer Association，CSCO)指南将K药提升为转移性结直肠癌的一线治疗一级推荐方案。

2022年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)大会报告的最新多中心研究显示，O药+Y药的双免方案针对化疗耐药的MSI-H结肠癌患者持续有效，再次证实双免治疗(用药持续时间超过1年)在化疗耐药的MSI-H转移性结肠癌患者中显示出持久的疗效，推荐O药+Y药作为化疗耐药的MSI-H转移性结肠癌患者的一线治疗方案[19]。

MSI-H的CRC如为黏液腺癌，免疫治疗效果不佳；传统的免疫治疗耐药相关基因B2M或JAK1/2突变并不影响MSI-H结直肠癌患者从PD-1抗体中获益[20]；对免疫治疗继发性耐药的CRC患者，手术干预仍然可以获得良好的效果；双免治疗可有效降低耐药性的发生。从后线单药(Keynote-164，CheckMate-142)、后线双药(CheckMate-142)，再到一线单药(Keynote-177)和一线双药(CheckMate-142)，免疫治疗在MSI-H/dMMR结直肠癌治疗中的地位不断攀升。MSI-H的mCRC患者全线推荐免疫治疗，且越早接受免疫治疗获益越大。有学者提出，对于MSI-H的CRC患者，不论分期如何，都应以临床治愈和无化疗的长期生存为治疗目标。但由于免疫治疗药物可能存在持续的或潜在的毒性，也需要平衡好疗效与毒性的关系。

临床上对MSI-H或dMMR状态的误诊，会导致使用K药作为一线治疗的患者中约30%的人出现疾病进展[21]。有研究证实MSI-H或dMMR的mCRC对免疫抑制剂原发耐药，主要是因MSI-H或dMMR状态误诊所致[22]。所以2020年结直肠癌患者免疫治疗专家共识提出，结直肠癌患者在接受免疫治疗前，应联合采用免疫组织化学方法(IHC)和聚合酶链反应+毛细管电泳(PCR+CE)方法检测dMMR和MSI-H，以避免误诊[23-24]。

2017年Science上发表的一篇研究显示免疫治疗不同种类的MSI-H患者时，其中晚期肿瘤患者(12个癌种)，中位PFS>14.8个月；MSI-H/dMMR的晚期结直肠癌，其客观缓解率(objective remission rate，ORR)21%(18/86)，疾病控制率(disease control rate，DCR)88%(76/86)；MSI-H/dMMR的非结直肠癌患者，其ORR 53%(46/86)，DCR 77%(66/86)，结果显示不同种类MSI-H肿瘤患者均能从免疫治疗中获益[15]。

所以MSI-H的CRC患者不推荐行5-FU单药化疗，靶向化疗建议使用贝伐珠单抗，MSI-H的结直肠癌全线推荐免疫治疗，且越早接受免疫治疗获益越大；临床上使用双免治疗可有效降低耐药性的发生，对于免疫治疗继发性耐药的CRC患者，手术干预仍然可以获得良好的效果；MSI-H的不同种类肿瘤患者同样推荐免疫治疗。

3.3 LS诊断与筛查

LS是一类常染色体显性遗传病，是由MMR基因胚系突变导致，约占结直肠癌的2%～5%；该综合征曾被命名为遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)，该命名因忽略了肠外肿瘤的高发生率而被弃用。已知MLH1、MSH2、MSH6和PMS2 4种MMR基因与LS的发生密切相关。大多数LS家族(85%～90%)可检测到MLH1和MSH2突变，剩余10%～15%家族为MSH6突变，少数存在PMS2突变及其他MMR基因突变。

LS所致的结直肠癌发病年龄较早，中位年龄约44岁；原发病灶多位于近端结肠，肿瘤多呈膨胀性而非浸润性生长；低分化腺癌和高中分化黏液腺癌较常见；瘤内淋巴细胞浸润、瘤周Crohn样淋巴反应常见；肠外恶性肿瘤发病率高。四分之一的LS结直肠癌患者在首诊10年内将第2次发生结直肠癌，每遗传一代发病年龄提前约10岁[25]。

LS患者可能发生多种肿瘤，常见肿瘤发生部位有结直肠、胃、胰腺、尿道、前列腺、卵巢、子宫等，遗传给子代的概率是50%。LS的筛查对肿瘤治疗和家系癌症风险预测都至关重要[26]。LS患者终身患癌风险较高：患结直肠癌风险达80%，子宫内膜癌风险达60%，卵巢癌风险达24%，胃癌风险达13%，远高于普通人群终身患癌的风险(5.0%，2.8%，1.2%，1.0%)[27]。

美国结直肠癌基因组学预防与应用工作组(EGAPP)建议：所有新诊断的结直肠癌患者均应检测MSI状态，以预测患者的预后情况，并确定哪些患者应进行LS基因筛查。最新的NCCN指南与国内CSCO指南，也均推荐所有结直肠癌患者都应进行MSI检测[12]。LS患者在其一生中易发生多处原发肿瘤。LS的结直肠癌患者常表现为同时性或异时性多原发结直肠癌。确诊LS的患者在发现第一处结直肠癌时，就应推荐进行扩大的结肠次全切除术或全切除术，可以使生命预期值增加1～2年[28]。

MSI检测可以作为LS的初筛手段，对于确定为MSI-H的患者，则采用LS致病基因MMR的胚系突变检测以明确诊断[28]。LS与胚系MMR基因(hMLHl、hMSH2、hMSH6、hPMS2、hMSH3和hPMSl)突变有关，其中MLHl、MSH2基因最易发生突变(85%～90%)，LS中没有BRAF基因突变；散发性MSI-H的结直肠癌则与MMR基因表观修饰失活有很大关系，通常伴有MLH1启动子CpG 岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype，CIMP)，50%的病例同时具有BRAF V600E基因突变，所以具有CIMP和BRAF V600E突变，通常可排除LS[29]。

早中期Lynch综合征CRC患者预后优于散发性CRC患者，Lynch综合征的筛查过程中发现微卫星高度不稳定(MSI-H)的肿瘤，一旦出现复发转移，患者对常规化疗的敏感性比散发性CRC患者要差，但这类患者接受抗免疫治疗的效果非常好，50%～60%可以获得非常好的肿瘤退缩，甚至长期生存[30-31]。

4 总结

MSI检测在结直肠外科临床工作中极其重要，所有新诊断的结直肠癌患者均应检测MSI状态。目前指南建议临床上MMR蛋白与MSI应共同检测，以提高诊断准确率，但是因检测的MMR通路蛋白少、检测位点少，仍然会存在漏诊；所以探索新的MMR通路蛋白、MSI检测位点及新的检测方式尤为重要。早发性CRC患者的MSI-H/dMMR频率更高，MSI-H最常见于Ⅱ期结直肠癌患者中；好发于近端结肠(右半结肠)，但MSI-H的CRC患者预后更好，所以临床上对于年轻的CRC患者，尤其是右半结肠癌患者，更应该重视MSI的检测。免疫治疗对于MSI-H的结直肠癌疗效显著，MSI-H的结直肠癌全线推荐免疫治疗，且越早接受免疫治疗获益越大，但是MSI-H或dMMR状态误诊可能导致免疫一线治疗患者疾病进展。MSI检测可以作为LS的诊断与筛查手段。结直肠外科医师应高度重视MSI检测，为结直肠癌患者提供更为合理的治疗方案；同时结直肠外科医师需要积极探索新的MMR通路蛋白、MSI检测位点及新的检测方式，以提高诊断准确率。