包装饮用水中铜绿假单胞菌生长曲线及其快速检测

◎ 覃 宇，向丽萍，吴金春，王 奥，任道援，张祖文

（遵义市产品质量检验检测院，贵州 遵义 563000）

铜绿假单胞菌作为一种对生长环境要求极低的致病菌，其繁殖能力极强，具有很强的耐药性，广泛存在于日常生活中，属于条件致病菌，会引发一系列疾病[1]。因此，对于该菌的科学研究及其重要。国内外对于该菌的研究主要有耐药性研究、致病因子研究、遗传物质研究等，而对于该菌的基础性研究比较少。本次研究是从包装饮用水这一日常生活中的必需品着手，研究铜绿假单胞菌在其中的生长情况及探讨一种快速确定其浓度的方法[2]，得到吸光度值与菌落数成反比[3]。使用此法可快速确定菌悬液中铜绿假单胞菌菌落数，对于后续开展相关试验可明显缩短试验时间，加快试验进程，也填补了铜绿假单胞菌基础性研究的空白。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要耗材

铜绿假单胞菌标准菌株Pseudomonas aeruginosa（ATCC 9027)、假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂、金氏B培养基、乙酰胺液体培养基、绿脓菌素测定用培养基、营养琼脂、氧化酶试剂、钠氏试剂和一次性接种环均购于广州陆桥技术有限责任公司。试验所用培养基需121 ℃灭菌15 min后使用；革兰氏阴性鉴定卡（GN卡）采购于梅里埃诊断产品（上海）有限公司。

1.2 主要设备

VITEK®2 compact全自动微生物分析系统（梅里埃诊断产品（上海）有限公司）、生物安全柜（苏净安泰空气技术有限公司）、隔水式培养箱（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、全自动立式压力灭菌器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）和紫外分光光度计（北京谱析通用仪器有限责任公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 绘制铜绿假单胞菌生长曲线

用一次性接种环挑取一环实验室保存铜绿假单胞菌标准菌株（编号ATCC 9027）污染自超市采购的经检测无菌落生长的5 L装包装饮用水（同一批次购买2瓶），在20 ℃下放置30 d，且在放置过程中，在其生长曲线的稳定期，吸取1 mL加入至另一瓶包装饮用水中，在4 ℃下放置35 d（在污染之前，每桶水分别取500 mL在各个温度下放置，留作空白对照），根据其在水中的铜绿假单胞菌的菌落数变化绘制生长曲线。

（1）标准菌株活化。将保存于-70 ℃超低温冰箱的铜绿假单胞菌标准菌株磁珠管取出放入4 ℃冰箱，让其磁珠温度升高。提前制备营养琼脂固体培养基，在超净工作台下完成以下步骤：用接种针挑取磁珠，在营养琼脂上划线，36 ℃下培养24 h。待营养琼脂上生长出铜绿假单胞菌单菌落后，开始下一步骤。

（2）操作步骤及培养。不同温度下保的试验样品，每间隔一段时间，从中吸取1 mL加入无菌培养皿中，倒入已灭菌的假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂，然后在36 ℃下培养48 h，然后计数，绘制生长曲线。

1.3.2 分光光度计法快速测定铜绿假单胞菌菌悬液浓度

（1）标准菌株活化，与1.3.1步骤相同。

（2）制备菌悬液。将上一步骤生长的铜绿假单胞菌单菌落加入装有3 mL浓度0.45%的无菌生理盐水中，用浊度仪调整其麦氏浊度为1 MCF（其中细菌浓度约为3×108CFU·mL-1），备用。

（3）测定吸光度值。取1 mL制备的麦氏浊度为1 MFC的菌悬液（其浓度约为3×108CFU·mL-1）加入到4 mL无菌生理盐水中，此时菌悬液被稀释5倍，其菌悬液浓度约为 0.6×108CFU·mL-1；将 0.6×108CFU·mL-1菌悬液取1 mL加入到9 mL生理盐水中，此时菌悬液被稀释10倍，菌悬液浓度约为0.6×107CFU·mL-1；以同样的方式，依次做梯度稀释，稀释度至菌悬液浓度约为0.5×102CFU·mL-1；用紫外可见光分光光度计在波长600 nm下测定不同稀释度的吸光度值[4]。

（4）测定菌落数。在超净工作台上用1 mL移液管吸取上一步骤中不同稀释度的菌悬液至无菌平皿中，每个稀释度做双平行。同时做生理盐水空白和培养基空白。适时导入合适温度的平板计数琼脂，待琼脂凝固后倒置培养，恒温培养箱中36 ℃，培养48 h，计数每个稀释度菌落数。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单胞菌生长曲线结果与分析

2.1.1 结果

20 ℃下铜绿假单胞菌生长曲线图如图1所示。由图1可知，铜绿假单胞菌生长稳定期在第4～6 d。在其菌生长的稳定期，吸取1 mL加入包装饮用水中，4 ℃下放置35 d，其试验样品结果生长曲线如图2所示。

图1 20 ℃铜绿假单胞菌生长曲线图

图2 4 ℃放置35 d铜绿假单胞菌生长曲线图

2.1.2 分析

由试验结果可知，铜绿假单胞菌对于生长环境要求不高，但其对温度特别敏感。在20 ℃下，其生长曲线包含细菌的4个生长时期：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。其稳定期为放置的第4～6 d，此期间其菌落数无变化，无其他干预手段，整个生长周期在30 d左右。但在4 ℃下，该菌基本不生长，菌落数一直呈现下降趋势，这也可以解释在冬天温度较低时，部分包装饮用水企业铜绿假单胞菌检出率不高的现象。

2.2 吸光度值与铜绿假单胞菌关系的结果与分析

2.2.1 结果

不同菌悬液浓度铜绿假单胞菌菌落数结果与对应的吸光度值见表1。由表1可知，当稀释度较高时吸光度值趋近于0。当铜绿假单胞菌菌落数在2.95×105CFU·mL-1，吸光度值为0.004，之后其吸光度值才开始呈现规律性变化。

表1 铜绿假单胞菌菌落数及吸光度值表

以铜绿假单胞菌菌落数为2.95×105CFU·mL-1、2.75×106CFU·mL-1、8.75×106CFU·mL-1、2.95×107CFU·mL-1和 4.75×107CFU·mL-1绘制标准曲线，见图3。以菌落数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，其相关系数达到0.997 8。

2.2.2 分析

由试验结果可知，当铜绿假单胞菌菌落数在2.95×105CFU·mL-1及以上时，其吸光度值变化明显，可以用紫外分光光度计测定其菌悬液中菌落数；而低于此菌落数时，其吸光度值变化不明显，当吸光度值趋近于零时不适用于紫外分光光度计法。因此，当铜绿假单胞菌落数需要快速得出时，且菌落数大于2.95×105CFU·mL-1或吸光度值在0.04及以上时，可以用紫外分光光度计法快速测出其菌悬液中菌落数，此时吸光度值与铜绿假单胞菌菌落数呈现正相关，其R2=0.997 8。

图3 铜绿假单胞菌菌落数与吸光度值的标准曲线图

3 结论与讨论

通过绘制铜绿假单胞菌在包装饮用水中的生长曲线可知：铜绿假单胞菌极易存活，当水厂被污染后难以彻底杀灭。若无其他干预手段，其生长周期在30 d左右。铜绿假单胞菌对生长温度极其敏感，可考虑从温度入手，再配合适宜消毒剂，杀灭该菌。绘制铜绿假单胞菌生长曲线，认识其在包装饮用水中生长规律将会帮助继续开展相关研究，也可以让饮用水厂更直观的了解该菌的生长情况。

通过用紫外分光光度计法测定铜绿假单胞菌菌悬液中菌落数和吸光值度值之间的关系可知，当菌悬液浓度较低或测出其吸光度值较低时，不适用于紫外分光光度计法。麦氏比浊法预测浊度为1.0 MFC时，铜绿假单胞菌菌落数为3.45×108CFU·mL-1，与预估的菌落数值存在差距，其绘制的标准曲线，R2=0.997 8，说明不同细菌种类大小和形态都有区别。

《食品安全国家标准 包装饮用水》（GB 19298—2014）产品标准规定包装饮用水不得检出铜绿假单胞菌[5]。现阶段对于该菌的杀灭方式主要是以消毒剂的方式对水厂区域及成品水进行消毒，通过上述该菌的生长曲线及与吸光度值关系两个方面的研究，当水厂区域环境及生产环节温度较低时，使用消毒剂消毒，可以达到更好的杀灭效果。而通过吸光度值与铜绿假单胞菌菌落数的关系，可以快速确定包装饮用水中该菌的菌落数含量。