外周血SEPT9 基因甲基化检测在胃癌诊断中的研究进展

赵路瑶 综述，李慕然，刘艳迪 审校

（1.南开大学医学院，天津 300071；2.天津市人民医院消化科，天津 300121）

胃癌是常见的恶性肿瘤之一。流行病学研究数据显示，胃癌的发病率在所有恶性肿瘤中排名第5位，但其死亡率却相对更高，位列第3 位[1]。目前胃癌的诊断金标准为内镜下活检的病理结果，但这种方法技术复杂，受检者依从性差，特别是对无症状的个体很难开展。临床上，用于胃癌预后指标的肿瘤标志物主要有癌胚抗原（CEA）、糖类抗原CA19-9 和CA72-4，单独诊断胃癌的敏感性为20.1%～27.6%，联合检测敏感性为48.2%[2]。这些检测手段或是技术复杂，或是敏感性和特异性低，迫切需要寻找简便易行、敏感高效的检测手段。Septins 是一种GTP 结合蛋白，Septin 9 基因是Septin 基因家族中的一员，在结直肠癌中，SEPT9 可以作为肿瘤生物标志物来诊断疾病，同时可预测预后、复发以及转移风险，其价值已在临床中得到证实[3]。由于结直肠癌和胃癌都是胃肠道肿瘤，它们都有一些分子特征，包括微卫星不稳定、高甲基化和基因突变，SEPT9 甲基化检测对于在胃癌中的筛查价值也逐渐引起关注[4-5]。本文对SEPT9 基因的结构特征、生物学功能、致癌机制，以及检测胃癌外周血SEPT9 基因甲基化的研究进展做一综述。

1 Septins 家族概述

Septins 在进化和结构上都与RAS 癌基因相关，广泛分布于除植物外的所有真核生物中。结构特征（图1）为一个G 结构域（G1 是以P-环的存在为特征，能够与核苷酸磷酸基团相互作用，G3 和G4与GTP 结合相关），以及N 端多碱性氨基酸结构域（polybasic domain）和C 端卷曲螺旋结构域（coiledcoil domain）[6]。哺乳动物基因组编码13 种不同的Septins（Septin1～12、14）。根据序列同源性和螺旋结构域的数量，可分为4 组：SEPT2（Septin 1，2，4，5）、SEPT3（Septin 3，9，12），SEPT6（Septin 6，8，10，11，14）、SEPT7[7]。不同组成员间有很强的亲和力，它们通过两个相互作用界面：G 界面和NC 界面，在折叠时相互靠近，聚合形成非极性三、六、八聚体[8]。其中由两个Septin 2/6/7/9 复合物组成的回文八聚体是大多数哺乳动物Septin 蛋白的基本单位，可进一步聚合成更高阶的结构，如细丝、环，以及通过端端和横向连接形成网状结构等[9]。

图1 Septins 基本结构

Septin 蛋白家族是继微管、微丝及中间纤维蛋白后发现的第4 种细胞骨架成分[10]，在细胞分裂、胞内物质转运、扩散屏障、细胞周期调控与细胞凋亡、细菌-细胞间相互作用、细胞突起、溶酶体稳态、囊泡转运、T 细胞发育等生理过程中发挥着重要作用[11-15]。多项研究表明，Septin 表达异常与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、神经肌肉疾病、阿尔茨海默病、生育障碍、恶性肿瘤等。在恶性肿瘤中，Septin与癌症发生的多种机制有关，如细胞持续增殖、抗细胞凋亡、血管生成、细胞迁移和侵袭、染色体不稳定、抗癌药物耐药以及癌症相关微环境改变等[10,16-17]。

2 Septin 9 概述

2.1 Septin 9 结构特征 Septin9 基因位于人类染色体17q25.3，包含17 个外显子，其长度约24×103bp[18]。与家族其他成员相比，Septin9 N 端含有长的脯氨酸区域，C 端缺少卷曲结构域。Septin9 是Septin 家族中唯一直接促进肌动蛋白聚合、交联的成员[19]。在哺乳动物中，SEPT9 经历了最多的选择性剪接，5′端产生6 个不同的mRNA 变异剪接体（SEPT9 v1、2、3、4、4*、5），3′端的外显子内部不对称的变异剪接亦可产生3 种不同mRNA（SV1、2 和3），因此，SEPT9 可有18 种转录产物，编码包括长型（SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3）、中等型（SEPT9_v4、SEPT9_v4*）和短型（SEPT9_v5）等15 种多肽[20]，造就复杂的生物学功能。

2.2 Septin9 的生物学功能 Septin9 是一种细胞周期相关蛋白。电镜观察表明Septin9 与F-肌动蛋白直接结合，维持肌动蛋白生长和收缩的完整性，使肌动蛋白细丝交联，弯曲成功能结构（如细胞运动收缩环、肌动蛋白应力纤维、细胞突起），促进局部黏附和上皮细胞运动[19，21]。此外，Septin9 结合并捆绑微管，通过介导胞外囊泡复合体到中体的定位，在胞质分裂中发挥重要作用[22]。因此，Septin9 沉默后将导致细胞分裂异常，最终产生多核细胞。研究发现Septin9 阻止接头蛋白CIN85（SH3KBP1）与泛素连接酶Cb1 的结合，负向调节泛素依赖的表皮生长因子受体（EGFR）降解，从而将Septin9 的分子活性与细胞增殖联系起来[23]。

3 Septin9 与癌症

3.1 Septin9 与多种恶性肿瘤 Septin9 参与许多生物过程，如胞质分裂、极化、囊泡运输、膜重建、脱氧核糖核酸修复、细胞迁移和凋亡，在多种恶性肿瘤的发展中发挥重要作用。Septin9 表达的改变可导致癌症，如结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、血液系统肿瘤、头颈部鳞癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等。Septin9基因的组织特异性及转录产物可变剪接，在不同肿瘤中转录表达模式不同，可以是表达减少、过度表达，也可以是产生融合基因，最终导致Septin9 各亚型表达失衡。如在结肠癌中，主要为SEPT9 v2 高度甲基化[24]；在卵巢癌上皮中SEPT9 v1 和v4* 高表达[25]；在乳腺癌中SEPT9 v1 高表达，v2 低表达[26]。随着对Septin9 功能的了解不断深入，人们逐渐认识到Septin不同于癌基因、抑癌基因，而是属于更广泛的癌症基因类别。Septin9 基因常在多种肿瘤细胞中异常表达，因此Septin9 蛋白可作为某些恶性肿瘤的早期筛查、诊断和预后的标志，并有可能成为抗癌治疗的新靶点。

3.2 Septin9 致癌机制 关于SEPT9 促进肿瘤发生、发展的机制，目前研究主要有HIF-1 信号通路、c-Jun 氨基未端激酶（JNK）信号通路、Rho 信号通路、细胞分裂异常、DNA 甲基化等机制。研究表明SEPT9_i1 的前25 个氨基酸（N25）与Septin 家族的其他成员相比是独一无二的，该N25结构域是SEPT9_i1 激活缺氧诱导因子-1（HIF-1）的关键区域，SEPT 9_i1 蛋白与HIF-1α 结合可增强其转录活性，同时防止其由RACK1 介导的降解来上调HIF-1 水平，增加下游基因如血管内皮生长因子的表达，促进血管生成和肿瘤的发生[27]。在整个细胞周期，特别是在G1 期，SEPT9_v1 上调激活JNK 信号通路，提高cyclinc D1 蛋白表达水平，抑制细胞凋亡和促进细胞增殖导致细胞周期以更快的速度进行[28]。SEPT9 还可以通过Rho 信号通路影响细胞骨架的形成，介导细胞间或与细胞基质间的黏附，进而影响肿瘤细胞的侵袭及转移[29]。在细胞分裂中，胞质分裂是有丝分裂的最后一步，涉及膜断裂的ESCRT（endocytic sorting complex required for transport）机制，Septins 在细胞中间体形成膜结合双环，双环提供ESCRT-Ⅲ膜组装位点，SEPT9 是ESCRT-Ⅲ环形成和扩张所必需的，SEPT9 通过与TSG101 相互作用，招募并组装ESCRT-Ⅱ/-Ⅲ亚基[11]。因此，SEPT9 表达异常致使有丝分裂纺锤体缺陷和无法完成细胞分裂，进而导致多倍体和非整倍体。

在细胞分化过程中，通过DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA 的改变等表观遗传事件使得某些基因的表达发生变化。与经典的遗传改变不同，表观遗传不涉及DNA 序列的变化，是潜在的可逆和可遗传的。其中DNA 甲基化是CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基在5′-碳位置甲基化，产生5-甲基胞嘧啶。在正常细胞中，大多数CpG 二核苷酸散在分布整个基因组中，通常是甲基化的；而一些CpG 二核苷酸聚集组成的CpG 岛，极少甲基化。但在肿瘤细胞中，以整个基因组的低甲基化和启动子CpG 岛高甲基化为特点。机制在于这些CpG 岛一旦发生甲基化，可抑制基因表达：一方面，DNA 甲基化改变其构象，使其不利于结合转录因子，抑制基因表达；另一方面，甲基化的DNA 分子招募并结合甲基化CpG 结合蛋白，这些甲基化CpG 结合蛋白继续与其他蛋白（如组蛋白脱乙酰酶）结合，最终形成致密的、不活跃的异常染色质，从而抑制基因的表达[6]。SEPT9 基因异常甲基化导致基因表达异常，引起机体生理功能异常，最终诱发肿瘤。

3.3 外周血SEPT9 基因甲基化在胃癌中的临床检测 一项在体细胞癌变目录（COSMIC）数据库中搜查SEPTS 突变情况的研究表明：SEPT9 在胃癌中的突变明显多于所有其他的SEPTS（~14%）；在前十位最常见的SEPTS 突变中，SEPT14 和SEPT9 在皮肤癌和胃癌中的频率分别为2.56%和1.86%，位居榜首[30]。因此我们可以认为SEPT9 与胃癌关系密切。Septin 突变发生的频率较低，甲基化频率高。启示检测几个频繁异常甲基化区域的甲基化可能比检测单个或少数突变标志物具有更高的灵敏度。

研究表明胃癌组织中Septin9 基因甲基化显著高于相应的癌旁组织[31]。考虑到样本获取的便利性，检测外周血DNA 甲基化水平无疑为无创胃癌检测提供了一个新的途径。目前对于外周血甲基化检测的研究（表1）有：2013 年Lee 等[32]对153 例胃癌患者的外周血样本进行研究，发现外周血SEPT9 甲基化检测的敏感度为17.7%，特异度为90.6%；且外周血甲基化SEPT9 阳性患者有远处转移倾向，无病生存率低；另外，该研究发现混合型（40.0%，2/5）、肠型（23.5%，12/51）患者的外周血SEPT9 基因甲基化与弥漫型（7.3%，6/82）相比有更高的阳性率。研究肯定了血浆mSEPT9 检测在胃癌中的价值，特别是在肠道、混合型、Ⅳ期胃癌患者中。2017 年Song 等[3]使用Epi proColon 2.0 血液检测试剂检测胃癌患者外周血，发现49.4%（44/89）胃癌阳性。同样地，2018 年Fu 等[33]研究血浆mSEPT9 对结直肠癌诊断价值时同样发现70%（7/10）胃癌患者血浆mSEPT9 阳性。

表1 胃癌患者外周血SEPT9 基因甲基化检测实验研究

2019 年曹长琦等[34]通过对74 例早期胃癌（EGC）患者血浆进行Septin 9、RNF180 甲基化检测发现：SEPT9 甲基化对EGC 的敏感度为28.3%，特异度为94.2%；在此基础上比较了与传统肿瘤标志物检测的差别，并得出结论：联合检测SEPT9 与RNF180阳性率最高，其次依次为RNF180、SEPT9、CA724、CA125、CEA、CA199。另外，RNF180/Sptin9 基因甲基化检测试剂盒（PCR 荧光探针法）的临床试验证实，该试剂盒检测胃癌的灵敏度为61.76%（420/680），特异性为85.07%（456/536）。分期灵敏性为Ⅰ期50.00%，Ⅱ期62.32%，Ⅲ期67.68%，Ⅳ期82.00%，分期不明为55.88%。2020 年Song 等[35]分析239 例胃癌患者血浆Septin9 基因甲基化水平时，发现其对胃癌的敏感度为47.7%，特异度为92.5%，而当mSEPT9 与CA724 结合时，敏感度提高到63.6%，特异度为91.1%，研究还证实治疗前mSEPT9 水平是长期生存率的良好预测因子。

综上所述，SEPT9 基因通过甲基化改变表达水平，在胃癌发生、发展中扮演复杂角色。通过对外周血SEPT9 基因甲基化检测可发现胃癌。与传统肿瘤标志物相比，SEPT9 基因甲基化检测有更高的灵敏度。通过将mSEPT9 测定其他标志物结合，检测的敏感性显著增强，更有助于临床实践。

Septin9 甲基化检测在胃癌早期诊断中的价值已凸显，但是具体作用的信号通路及机制需要深入研究。由于Septin9 复杂的异构体的存在，目前仍然无法清楚地阐明mSETP9 和Septin9 表达之间的关系，对于SEPT9 基因是否是癌基因的问题仍存在争议，因此未来应细化Septin9 各亚型，研究其在癌症中的作用。此外，SEPT9_v2 启动子高甲基化是结直肠癌形成过程的特有表现，其成功用于外周血检测筛查结直肠癌，提示我们未来胃癌甲基化生物标志物研究应考虑到特异性剪接变异体的作用。再者，可通过优化外周血SEPT9 基因甲基化检测技术，提高检测准确性，开展大样本随机对照实验，进一步研究定量DNA 甲基化与胃癌病程进展的关系，在早期筛查、诊断、靶向治疗、疗效评价、预后和复发监测中发挥新的作用。