非侵入式散射介质内多光谱重建

田冰心，韩军，刘丙才，龚昌妹

（西安工业大学光电工程学院，西安710021）

0 引言

光谱作为化学物质的一个重要特征，通常可用于分析化学成分、结构等信息，因此在生物医学［1-2］领域有广泛应用。然而由于散射介质的扩散特性，探测器接收到的信号变成一组杂乱无章的散斑信息［3］，无法直接成像，因此对于隐藏在散射介质内部目标信号探测显得尤为困难。近年来许多方法被提出以实现透过散射介质的目标成像［4］。波前整形［5-6］作为通过散射介质聚焦和成像的一个有效的解决方案，使用计算机控制空间光调制器优化输入光波前，使其以干涉方式反转散射效应，将光束聚焦到目标上。然而最初，反馈信号是通过放置在散射介质后面的探测器来测量［7-8］，或者利用在“引导星”上重新覆盖［9］的方式获取，因此是侵入式的，这对生物医学应用来说是不可行的。最近，非侵入式的波前整形技术被提出［10-11］，解决了物理方式侵入散射介质的问题，但由于输入相位的随机性导致成像精度不高，且成像过程耗时较长。2012年，BERTOLLOTI J 等［12］报道了一种光学方法，该方法可以对完全隐藏在薄散射层后的荧光目标成像，且无需进入散射介质后面的区域。该技术利用散斑相关，即散斑的自相关与目标的自相关具有很好的近似性这一特性，实现对散射介质后目标的非侵入式成像。另外，基于光学记忆效应的散射成像技术也具有非侵入式的特点，且对于光源、介质和系统的要求较低。随着对散斑相关技术和光学记忆效应研究的深入，利用散射介质的相关特性，可实现透过散射的光谱成像［13-15］。利用强度光谱传输矩阵技术重建介质内目标光谱时［13］，通常可以通过一个光纤光谱仪从散斑信号中获取光谱信息。然而多模光纤构成的光谱测量系统虽然具有高的光谱分辨率，但其抗扰动性差，对机械结构的稳定性要求非常高，并且这些算法无法分辨散射介质内多目标光谱。2018年，研究者利用矩阵分解的方法实现对拉曼快速光谱成像［16］，这一技术需要通过扫描仪对成像面的像素扫描获取光谱数据立方体，再对其压缩重建，实验系统结构复杂。2020年，BONIFACE A［17］利用矩阵传输技术结合非负矩阵分解（Nonnegative Matrix Factorization，NMF）算法，实现了散射介质内荧光目标的2D 成像，但却无法对不同化学物质的光谱进行解析。理论上讲，在多个散斑输入的情况下，探测器接收到目标的多重信息，这恰好为光谱解析提供了足够的数据支撑。实际上，早在2011年，非负矩阵分解（NMF）算法［18-19］被证实作为一种广泛应用的盲谱分解方法，可以利用采集到的混合光谱数据解析出每种目标的光谱信息。尽管如此，在非入侵且无波前整形技术下，实现透过散射介质的目标光谱重建仍极具挑战。

本文提出了一种新的非侵入式光谱重建方法。该方法通过非侵入式的探测手段，利用随机散斑照明激发目标，并用成像光谱仪记录目标信号，结合非负矩阵分解（NMF）的方法对所获取信号进行解析，从而实现多个目标光谱的重建。此算法利用光谱解析的过程，不仅能够实现散射介质内的多个目标的分辨，而且能从混叠谱中同时恢复多个光谱，适用于任何一种线性激发信号，为散射介质内多目标的分辨、聚焦和信号增强提供技术支撑。同时在应用方面，将重建后的光谱信号作为非侵入透过散射介质聚焦的先验知识，实现了透过散射介质的非侵入式选择性聚焦。该方法在生物医学探测和检测领域有着广阔的应用前景。

1 基本原理

非侵入式散射介质内多光谱重建技术原理如图1。图1（a）为原理结构图。由散斑产生器（Speckle generator）生成的p个随机散斑Ein经过二色分光棱镜（DM）后，被显微物镜（Obj）投射到散射介质中。Ein经过样本中散射介质（SM）的传输形成激发散斑Eexc，用于照明散射介质内的目标。目标是由具有不同光谱信号的荧光粒子组成。激发的荧光信号反向传播，经过散射介质的扩散作用后，通过显微物镜（Obj）和二色分光棱镜（DM）被成像光谱仪（Imaging spectrometer）接收。其中，散斑产生器可以是毛玻璃、空间光调制器等光学器件，用来产生照明用随机散斑。对每一个照明散斑Ein，通过散射介质后形成相应的激发散斑Eexc照明介质内目标，并在成像光谱仪中形成一个三维的空间-光谱信号。依次输入p个照明散斑Ein，相应的生成p个激发散斑Eexc照明介质内目标，最终在成像光谱仪中成为一组完全混叠的空间-光谱信号。记录这一信号，并对其解混叠，如图1（b）所示。光谱解混过程首先需要将混叠的三维信号重新整合成一个二维的目标信息矩阵Ifluo，最后利用NMF 算法对矩阵进行分解，得到目标的特征光谱矩阵W和权重矩阵H，从而重建目标的原始光谱。

图1 非侵入式散射介质内多光谱重建原理Fig.1 The schematic of non-invasive multi-spectral reconstruction in scattering medium

1.1 多随机散斑输入

散射介质内荧光粒子受到激发时，会在探测器上产生相应的荧光散斑。当N个荧光粒子同时激发，每一个荧光粒子发出的散斑相互叠加，最终在探测器中形成一个混叠散斑信号。由于荧光是非相干光，因此这个散斑信号可以看作是由每一个粒子的散斑通过不同的权重映射后非相干叠加的结果。因此当用一个激光散斑照射一组荧光粒子时，得到一个叠加的荧光信号If，可表示为

式中，a1，a2，…，aN，是N个荧光粒子在混叠散斑中所占的权重值。这在成像光谱仪中表现为一组混叠的光谱信息，即

式中，S为N个荧光粒子混叠后的光谱信息，S1，S2，…，SN为N个荧光粒子的特征光谱。对于给定的一组混叠的光谱数据，为了恢复其中每一种物质的光谱，需要识别数据中物质属性，以及对探测器中像素进行分类，即确定每一个像素中包含的物质属性及其权重。对成像光谱仪来说，每一个像素中所包涵的物质的特征光谱，通过各自所占权重值组成了一个线性组合，线性组合中的权重分别对应于该像素中这些物质所占比例（这正是NMF 模型）。因此，为了求解线性组合中的多个光谱特征，利用散斑产生器生成多个激光随机散斑Ein照射荧光粒子。每一个随机散斑照射荧光粒子后，会激发出相应的荧光信号，从而建立光谱数据的线性组合，即

式中，p为输入随机散斑的数量；S1，S2，…，Sp为p组混叠的光谱数据。a是N个荧光粒子在输出信号中所占的权重值，p≫N。

假设被照明的N个粒子属于r个不同的特征光谱，尽管由于激发状态的不同，同一种物质的光谱会存在强度上的线性关系，但其光谱特征是相同的，因此，在混叠散斑中实际上仅存在r个特征光谱，且相同物质的每个谱线存在线性关系。也就是说对于式（3）来讲，系数矩阵是足够稀疏的，方程组的秩为r，因此可将其化简为

式中，A表示不同物质的权重，表示r种不同物质的特征光谱。

1.2 非负矩阵分解

非负矩阵分解（NMF）是多变量分析和线性代数中的一组算法，通常可用于数据降维。给定一个具有非负元素的M维随机向量X，X中包含N个观测值xi，i=1，2，…，N，写成矩阵形式则为X=，NMF 算法意在将X分解成两个低秩非负矩阵U和V，即X≈U×V。其中U是一个非负M×L矩阵，V是L×N矩阵，显然，V是U中观测列的系数，即X的特征向量上的权重系数。因此NMF 将每个数据分解为基本向量的线性组合。由于初始条件L≪min（M，N），获得的基向量在原始向量空间上不完整，即这种方法试图用更少的基数来表示高维随机模式。因此利用NMF 对混合数据做低秩分解是光谱解混的一种直观且有效的方法。

结合1.1 节中分析，对于单次随机散斑照明而言，成像光谱仪所获取的信号是一个光谱数据立方体，如图1（b）。将数据立方体重新整合之后成为一个二维的光谱信号，由式（2）表示。当进行p个随机散斑照明目标后，会形成一个三维的混叠光谱信号，对应的数据矩阵由式（3）表示。对这个三维矩阵进行像素维度的压缩处理，最终到得到一个二维矩阵I，矩阵大小为λ×p，其中p为散斑数量，λ为光谱通道。由于像素的光谱特征是入射光在不同波长下被该像素反射的比例，是非负的，因此I是一个非负矩阵，矩阵的列为成像场景中目标对应每一次照明的特征光谱。压缩矩阵I经过NMF 低秩分解成大小分别为λ×r和r×p的两个非负矩阵W和H，则有I≈W×H，其中，r是物质的种类。在形成的低秩矩阵中，W是特征光谱矩阵，矩阵中的每一列对应不同物质的特征谱。因此对矩阵W中的数据进行重新整合，便是各个物质的光谱数据。H为系数矩阵，H中的每一列表示每个像素中不同物质所占比例即权重值。值得强调的是在非负矩阵分解方法中，W×H是I的低阶近似。在整个分解过程中，选择W和H以最小化I和W×H之间的均方根残差D，其中：为Frobenius 矩阵范数［20］。

2 仿真实验结果

基于非侵入式散射介质内多光谱重建原理，建立的实验装置如图2。激光光源通过空间光调制器（SLM）产生多个随机照明散斑Ein，被显微物镜（Obj）投射到样本中。照明散斑经散射介质散射后产生激发散斑Eexc，并照射荧光粒子。荧光信号反向路径传播，经过分光镜（DM）的过滤和折返作用后被成像光谱仪接收。图中L 表示棱镜，L1 和L2 组成4f光学系统，用于调节光束的大小。实验中利用MATLAB 建立仿真模型，模拟两种具有不同光谱特征的粒子作为测试样本中的目标，并通过散射层构建样本中的散射介质。仿真过程中的基本参数如表1。

图2 实验装置示意Fig.2 Schematic of experimental setup

表1 主要仿真参数Table 1 Primary simulation parameters

仿真中，利用波长为532 nm 的单色激光作为输入光源，经过SLM 的相位调制作用，在激光光斑上叠加随机相位形成随机散斑照明。携带有随机相位信息的照明散斑被显微物镜（20×，NA 为1.0）收集，经过夫琅禾费传输后产生激发散斑照明样本，激发荧光目标。被激发的荧光信号反向传输经过散射介质后被成像光谱仪接收并记录。重复上述过程，更改SLM 上的随机相位模式，产生新的随机散斑照明，并记录新的荧光信号。重复p次，相当于用p个随机散斑照明样本中的目标。从而获得相应的光谱数据。仿真过程中，样本由散射介质和目标粒子组成。散射介质是由6 个散射层叠加而成，散射层之间的距离为20 nm，各向异性因子为0.69。散射粒子尺寸为1 个像素。

对成像光谱仪中获取的目标信号重新整合后，利用NMF 算法提取目标的不同光谱特征，并进行光谱重建。对具有两种光谱成分的样本进行实验，光谱重建结果如图3（实线表示原始谱，虚线表示重建谱），图3（a）和（b）分别为两种光谱成分的重建光谱。利用原始光谱与重建光谱的相关性（Correlation，以下简写为“CORR”）以及均方根误差（Root Mean Square Error，以下简写为“RMSE”）两个指标评估光谱重建效果。光谱相关性越高，均方根误差越小，则光谱重建效果越好。光谱相关性和均方根误差分别表示为

式中，̂为重建的光谱，S为输入原始光谱。是重建光谱与原始谱的光谱协方差，Var(S)和表示原始谱和重建谱各自的方差。

图3 中可以看出，在输入随机散斑数量p=1 000 时，两种物质的重建光谱与原始光谱相关性分别为：CORR1＝0.998 9；CORR2=0.998 5。其均方根误差分别为RMSE1＝0.019 1，RMSE2＝0.014 8。

图3 光谱重建结果（p=1 000）Fig.3 Results of spectral reconstruction（p=1 000）

3 分析与讨论

3.1 多个光谱重建

当样本中具有两种以上光谱成分时，对其进行光谱重建的实验。由于在NMF 算法中，原始数据的可靠性一部分取决于输入散斑，因此为了研究不同数量的输入散斑对NMF 算法的影响，在仿真过程中，依次令输入散斑数量p为200、400、600、800 和1 000，仿真结果如图4。图4 表示对四种光谱成分的样本进行光谱重建仿真的结果，图（a）、（b）、（c）和（d）分别为四种光谱成分的重建光谱。这一结果表明本方法能够同时有效地重建散射介质内多个光谱。

图4 不同输入散斑数量的光谱重建结果Fig.4 Results of spectral reconstruction with different input modes

3.2 输入散斑数量

根据3.1 节中四种光谱成分的实验结果，对不同输入散斑数量，计算每种谱线重建光谱与原始谱的相关系数和均方根误差，并求其平均值，结果如表2。

表2 不同输入散斑数量的光谱重建结果Table 2 Results of spectral reconstruction with different input modes

由表2 可见，当散斑数量小于400 时，原始光谱与恢复光谱之间的相关性小于0.99，并且均方根误差较大，此时，表明光谱重建精度不高。这是因为当输入散斑数量较少时，由于数据组不能将所有光谱信息覆盖，导致光谱恢复质量不高。当散斑数量为600 时，尽管光谱恢复效果有所提高，但其均方根误差仍然没有达到理想误差范围。随着散斑数量增加，原始光谱与重建光谱的均方根误差逐渐变小，光谱相关性逐渐增大。当散斑数量为1 000 时，原始光谱与重建光谱的相关性达到最大，均方根误差达最小。实际上，当随机散斑的数量再次增加时，均方根误差不会变小，这是因为当散斑的数量非常大时，其数据冗余量达到很大的值，因此在数据计算时，有很大可能用到无效散斑，使光谱恢复质量不高。同时由于散斑数量越多，数据库越大，处理数据所需的繁琐程度也会随之增大。因此为了保证光谱重建质量的同时减小运算量，本次仿真选取1 000 个随机散斑作为输入。在图4 中也可以看出，当有1 000 个随机散斑时，重建的目标光谱更接近原始谱，且均方根误差以及光谱相关性达到一个最优解。

3.3 光谱相似度

从实验结果可知，本方法可以同时重建多个光谱，然而，原理上来讲不同光谱之间的相似程度也是影响重建质量的因素之一。为了分析不同光谱之间的相互作用，在仿真过程中，使用两个随机光谱作为原始谱进行重建。用两个原始谱之间的点乘值（Dot.pro=S·Ŝ）表示光谱相似度，Dot.pro 值越大，说明谱线相似度越高，反之，相似度越低。分别运行当相似度小于0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 时的两个原始谱的仿真实验，并求其平均值。结果如表3所示。从表中可以看出，随着相似度的减小，当两个原始光谱相似度小于0.6 时，原始光谱与重建光谱的相关性高于0.99，均方根误差小于0.02，说明光谱可以得到准确重建。并且在相似度越小的情况下，其重建效果越好。

表3 不同相似度光谱重建结果Table 3 Results of spectral reconstruction with different similarity

4 应用举例

非侵入式散射介质内多光谱重建的一个重要应用是散射介质内的聚焦。当散射介质内有多个光谱成分的目标存在时，分辨目标并选择性地聚焦在指定目标上仍具挑战。利用本文提出的技术可以通过重建隐藏在散射介质内的目标光谱，并利用重建光谱作为先验知识，实现对散射介质内或透过散射介质目标的选择性聚焦。基于此原理，将两种具有不同光谱特征的粒子作为目标，利用本文所提出的方法对目标光谱进行重建，并结合光谱解析方差优化算法［22］进行选择性聚焦仿真实验，实验结果如图5。S1和S2分别是两种粒子（虚线标注和实线标注）的光谱特征，优化前，激发散斑随机分布在目标粒子上（左图）。在进行多次优化实验后，优化后的激发散斑（右图）均聚焦在对应的目标粒子上（S1对应虚线标注的粒子和S2对应实线标注的粒子）。由此可见，利用本文所提出方法能够有效地实现透过散射介质的选择性聚焦。

图5 散射介质内目标选择性聚焦Fig.5 Selective focusing on the targets in the scattering medium

5 结论

本文提出一种新的散射介质内多光谱重建的光学方法。该方法通过散斑发生器产生多个随机散斑照明，并通过显微物镜投射到样本中，用于激发目标。被激发的荧光沿着反向路径传播，经过散射介质的扩散作用后被成像光谱仪接收。荧光信号经过重新整合后，形成一个二维的光谱数据矩阵，利用NMF 算法对矩阵进行解析，提取特征光谱，从而重建不同物质的光谱。首先通过仿真实验验证方法的可行性。其次通过对比不同参数情况下的实验结果，分析该方法的适用条件。实验结果表明，这种光谱重建方法利用多散斑输入的模式，结合光谱解析的过程，可以实现散射介质内部的多个目标的分辨并且进行多个光谱的可靠重建。最后，通过应用实例，即对散射介质内目标选性聚焦的仿真实验，结合非侵入式光谱解析聚焦算法，验证本方法能够实现散射介质内不同目标的选择性聚焦。本文方法不仅为隐藏在散射介质内部或后面的目标成像以及信号增强提供了技术支撑，且为生物组织内目标分辨提供一种新的思路。