甲砜霉素对中华鳖血清生化指标、抗氧化酶活性及组织结构的影响

刘 莹，张永刚，李先国，张大海，李兆新，邢丽红，孙晓杰

(1.中国海洋大学化学化工学院，山东青岛 266100；2.青岛市渔业技术推广站，山东青岛 266071；3.中国水产科学院黄海水产研究所，山东青岛 266071)

中华鳖()又称甲鱼、水鱼，是世界上重要的水生爬行动物物种之一，广泛分布于中国、日本、韩国等亚洲国家，并因其高营养和高药用价值而闻名。目前，中华鳖已成为我国淡水养殖中重要的经济养殖品种之一，2019年我国鳖的养殖总产量约为32.5万吨。然而，随着中华鳖养殖产业的迅速扩大、养殖密度增加、水环境恶化，使得养殖过程中细菌性疾病大规模爆发，且感染率及死亡率较高，导致严重的经济损失，阻碍了中华鳖养殖业的健康持续发展。

甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)为第二代人工合成的氯霉素类广谱抗菌药物，抑菌效果及作用机理与氯霉素相似，但是毒性有所降低。因其低成本、吸收快，与常用抗菌药物无交叉耐药性等特点，被广泛应用于畜禽和水产养殖业细菌性疾病预防和治疗过程中。但是由于在养殖过程中的过度使用、滥用，导致TAP在养殖环境中残留，对生态系统和人类健康造成严重的负面影响。已有研究表明，TAP在一定剂量下具有较强的血液毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用，甚至可影响动物、植物和微生物的生理功能。目前，关于TAP在松浦镜鲤()、鲫()、大菱鲆()、眼斑拟石首鱼()等水产动物的血液毒性或药物代谢动力学的研究已有较多报道，但关于TAP对中华鳖毒性的研究鲜有报道。

本实验在水温26.0 ℃条件下，研究了口灌不同用药剂量的TAP对中华鳖血液生化指标、组织抗氧化酶活及各组织器官损伤的毒性作用，旨为指导TAP在中华鳖病害防控过程中的科学使用提供基础数据和临床用药理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用中华鳖规格约(500±50)g/只，由山东省平度百岁泊中华鳖养殖基地提供。实验鳖暂养在养殖池中7 d后，选取体质健壮、活力强、无病无伤的中华鳖进行实验，给药前停饲24 h。养殖池规格为150 m，水深 1.5～2 m，中华鳖养殖密度约300只/池，投喂饲料为幼鳖饲料。

1.2 药品与试剂

TAP标准品(纯度≥99.5%)，购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；TAP原料粉(纯度≥99.5%)，生产批号：C10056838，购自上海麦克林公司。

血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(UN)、血糖(GLU)、氯离子(Cl)、钾离子(K)、钙离子(Ca)和碱性磷酸酶(AKP)等血清生化指标试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)组织抗氧化相关指标测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.3 TAP药物配制

参考2015年版《中华人民共和国兽药典》中TAP对鱼的推荐用药剂量(16.7 mg/kg)，使用0.9%生理盐水将TAP原料粉配制浓度为16.7、50.1及83.5 mg/mL的药液(鱼推荐用药剂量的1、3、5倍)。

1.4 实验方案设计

设3个实验组(16.7、50.1及83.5 mg/kg)和1个对照组，每组设置3个平行，每个平行10只中华鳖，取样时自每个平行中取3个样品作为生物学重复(=3)进行测定。为了保持给药量精确，给药采用口服灌喂方式。用带有橡皮软管的注射器吸取0.5 mL的药液，将注射器慢慢深入中华鳖口中灌喂，保持中华鳖形体竖立约半分钟，然后放入养殖水槽正常饲养。若有回吐，则弃去，再新取另一只口灌。对照组口灌等同体积的生理盐水。实验共进行4 d，口灌1次/d，实验期间水温保持在26.0 ℃。

1.5 样品采集方法

中华鳖给药停止24 h后采样。每组随机取3只中华鳖采集血液，之后依次取肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉、睾丸和精巢等组织。

1.6 血液生化指标测定方法

采集的血液在室温静置2～3 h后，置于4 ℃冰箱过夜，以4 ℃ 5 500 r/min离心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中备测。按试剂盒说明书中步骤，分别测定血清中TP、ALB、ALT等10个生理生化指标。

1.7 肝脏、脾脏抗氧化指标的测定方法

将采集的肝脏和脾脏组织匀浆处理，按试剂盒说明书中步骤，测定组织中SOD、CAT、NOS活性及MDA含量。

1.8 组织切片处理方法

将采集的中华鳖肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肌肉、肠道、精巢和睾丸等组织或器官在Davidson’s固定液中固定24 h后，将固定液换成70%的乙醇。参照王凯的方法，进行样品的脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)和染色等处理后，在光学显微镜下观察、拍照。

1.9 数据分析方法

2 结果与分析

2.1 TAP对中华鳖血清生理生化指标的影响

对照组及实验组血清生理生化指标测定结果如表1所示。与对照组相比，给药组血清中的ALT和AST均有所增加，在83.5 mg/kg剂量组达到最高值，分别为对照组的7倍和3.7倍；AKP、ALB、TP、K及GLU等血清生化指标在16.7 mg/kg剂量组显著升高，随着用药剂量增加，含量逐渐降低，83.5mg/kg剂量组的AKP活性低于对照组，其他均高于对照组。Cl浓度随着TAP的使用有所降低，Ca的浓度变化不显著。

表1 TAP对中华鳖血清中生理生化指标的影响

2.2 TAP对中华鳖肝脏、脾脏抗氧化指标的影响

2.2.1 TAP对肝脏SOD、CAT、NOS活性和MDA含量的影响

如图1所示，与对照组相比，16.7 mg/kg剂量组肝脏中的SOD和NOS活性显著增加，具有明显的诱导作用；而50.1和83.5 mg/kg剂量组活性逐渐降低。肝脏中的CAT活性在50.1 mg/kg剂量组达到最高值，83.5 mg/kg剂量组活性逐渐降低但仍高于对照组。16.7 mg/kg剂量组肝脏中的MDA含量有所下降，50.1和83.5 mg/kg剂量组活性逐渐升高，在83.5 mg/kg剂量组最高。

图1 TAP对中华鳖肝脏抗氧化酶活性的影响

说明TAP以推荐剂量口灌中华鳖时，对肝脏的SOD、CAT、NOS活性起到诱导作用，当超过一定浓度范围时，诱导作用逐渐减弱。而肝脏MDA含量的变化趋势与之相反，在16.7 mg/kg剂量组，肝脏MDA含量与对照组相同，随着给药剂量的增加，MDA含量呈逐渐上升的趋势，在83.5 mg/kg剂量组时，MDA含量达到最高值。

2.2.2 TAP对脾脏SOD、CAT、NOS活性和MDA含量的影响

口服灌喂TAP前后，中华鳖脾脏中的SOD、CAT、NO活性和MDA含量测定结果如图2所示。与对照组相比，各给药组脾脏的SOD、CAT、NOS活性呈先升后降的趋势，在16.7 mg/kg剂量组时均达到最高值，50.1和83.5 mg/kg剂量组显著降低，且均低于对照组。说明在规定剂量浓度下口灌TAP，可诱导中华鳖脾脏SOD、CAT、NOS活性，反之则降低。而MDA含量与对照组相比，16.7 mg/kg剂量组显著低于对照组，随着给药浓度的增加，MDA含量呈上升趋势，83.5 mg/kg剂量组MDA含量最高。

图2 TAP对中华鳖脾脏抗氧化酶活性的影响

2.3 TAP对中华鳖组织损伤的影响

肾脏:对照组中华鳖肾脏由许多肾小管和少量结缔组织构成，组织结构清晰，排列整齐，未见有组织病理变化(图版I-肾脏A)。与对照组相比，16.7 mg/kg剂量组肾脏组织结构较清晰，但管腔内有少量炎性细胞出现(图版I-肾脏B)；而随着给药剂量的增加，50.1 mg/kg剂量组肾小管管壁增厚，炎性细胞增多(图版I-肾脏C)；83.5 mg/kg剂量组组织界限模糊(图版I-肾脏D)。

肝脏:对照组与16.7 mg/kg剂量组肝组织致密、结构清晰，肝细胞呈多角状，排列整齐紧密，呈放射状围绕中央静脉排列(图版I-肝脏A-B)；50.1 mg/kg剂量组肝小管出现炎症，管壁细胞肿胀彼此融合(图版I-肝脏C)；而83.5 mg/kg剂量组肝血窦扩张严重，有大量炎性细胞浸润，肝细胞染色浅淡(图版I-肝脏D)。

脾脏:对照组与16.7 mg/kg剂量组脾脏红髓和白髓结构明显，排列有序，成熟红细胞、淋巴细胞、单核细胞、吞噬细胞等密集相间，未见有组织病理变化(图版I-脾脏A-B)；随着给药剂量的增加，50.1 mg/kg剂量组脾脏小梁静脉中充满大量炎性细胞(图版I-脾脏C)；83.5 mg/kg剂量组小梁动脉出现炎症，管壁增厚(图版I-脾脏D)。

肠道:对照组与16.7 mg/kg剂量组肠由黏膜、肌层和浆膜三层构成，黏膜层结构完整，黏膜上皮清晰，细胞类型正常，未见有组织病理变化(图版I-肠道A-B)；50.1 mg/kg剂量组肠绒毛结构不完整，出现脱落现象，细胞核固化(图版I-肠道C)；随着给药剂量的增加，83.5 mg/kg剂量组肠纹状缘、固有膜严重受损，杯状细胞增多(图版I-肠道D)。

心脏:16.7 mg/kg剂量组与对照组心肌纤维排列有序、相互纵横交叉，构成复杂的网状组织，无组织病理变化(图版I-心脏A-B)；随着给药剂量的增加，50.1 mg/kg剂量组心肌纤维断裂现象逐渐严重，其间有大量炎性细胞浸润(图版I-心脏C)；83.5 mg/kg剂量组心外膜受损，心肌纤维断裂，部分组织出现崩解现象，呈空泡状(图版I-心脏D)。

精巢:16.7 mg/kg剂量组与对照组精巢结构完整无病理特征，精小囊内充斥着大量的生殖细胞，细胞质致密(图版I-精巢A-B)；随着用药剂量的增加，50.1 mg/kg剂量组精小囊内生殖细胞逐渐减少，生精小管受损(图版I-精巢C)；而83.5 mg/kg剂量组精小囊内生殖细胞完全消失(图版I-精巢D)。

睾丸:睾丸间质由结缔组织细胞和间质细胞组成，对照组与16.7 mg/kg剂量组曲精管腔结构清晰，内腔充满了大量生殖细胞群体，未见病理变化(图版I-睾丸A-B)；随着用药剂量的增加，50.1和83.5 mg/kg剂量组曲精管腔内生殖细胞或游离的精子逐渐减少(图版I-睾丸C)，83.5 mg/kg剂量组受损程度严重，曲精管腔留有大面积的空白区域(图版I-睾丸D)。

肌肉:肌肉由白肌和红肌组成，肌纤维成束排列，红肌横断面为圆形或近圆形，白肌为三角形或多边形，16.7和50.1 mg/kg剂量组肌肉组织结构与对照组相似，组织结构正常未见病理变化(图版I-肌肉A-C)；而83.5 mg/kg剂量组的肌肉细胞核固化，肌原纤维受损，导致肌束间间隙增大(图版I-肌肉D)。

图版I 口灌TAP对中华鳖组织的病理变化

3 讨论

3.1 TAP对中华鳖血液生化指标的影响

血液在动物体内有着十分重要的作用，参与机体的新陈代谢、防御、免疫及维持内环境稳定等，血液学指标不仅能反映动物的生理状态，也广泛用于评价动物的健康状况。目前，关于TAP对鱼类血液毒性的研究已有报道，但对于中华鳖血液毒性的研究较少。

本实验采用口灌的方法，研究了TAP对中华鳖10项血清生化指标的影响，发现TAP对中华鳖血清生化指标影响显著，且存在明显的剂量效应关系。在本研究中，ALT、AST活力与药物浓度成正比，在83.5 mg/kg剂量组达到最高值，明显高于对照组，与杨洪波等报道的TAP对松浦镜鲤血清生化指标影响的结果一致。Sobhy等也报道成年小鼠以16 mg/100 g体质量服用TAP 7 d，其血清AST、ALT显著升高。ALT、AST主要分布于肝细胞内，为肝脏中两种重要的指示酶，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，由此可见，TAP对中华鳖肝脏可能有一定的损伤作用。

TP、ALB可反映动物机体组织器官功能状态，肝肾功能受损可引起其在血清中含量的降低。在本研究中，16.7 mg/kg剂量组血清TP、ALB含量显著高于对照组，但随着药物浓度的增加而逐渐降低。说明TAP在推荐剂量下可提高机体的蛋白合成代谢功能，当超过阈值时导致肝肾功能受损，含量降低。本结果与唐海蓉等报道的TAP对肉鸡血清TP、ALB变化趋势的影响存在一定差异，可能与实验动物和实验周期不同有关。

UN及动物机体内环境中各种离子浓度的变化，对机体健康状况有着重要的影响，均可衡量肾脏功能的受损情况。UN来源于肝脏，而通过肾脏随尿排出，当肾脏受损时，滤过增多，血清中含量就增高；UN较低表明机体蛋白合成效率高。在本研究中，16.7和50.1 mg/kg剂量组UN含量和对照组无显著差异，而83.5 mg/kg剂量组显著高于其他三组；实验组K浓度显著高于对照组，Cl浓度显著降低，Ca无显著差异，表明TAP对中华鳖血清Ca浓度影响较小。本研究结果与唐海蓉等的报道结果相似，可能由于随着药物浓度的增加，加大了肝肾负担，对肝肾的代谢功能造成了一定的压力，降低了蛋白合成效率，导致其相对应的指标含量下降。

AKP是生物体的一种重要的代谢调控酶，在碱性环境下能水解磷酸单酯起到解毒、免疫防御的作用。在本研究中，血清AKP活性在16.7 mg/kg剂量组显著升高，50.1和83.5 mg/kg剂量组显著降低。SONG等报道，当大量病毒在血细胞内繁殖时，血细胞会大量减少，同时AKP的活性也会下降。原理可能与其相似，当中华鳖在推荐剂量下口灌TAP时，可促进血细胞的生产，提高血清AKP的活性，对外界刺激可达到免疫防御的作用，反之则降低。血清GLU可反映机体在胁迫环境中体内代谢和组织器官的功能状态。本研究中，实验组血清GLU含量显著高于对照组。

3.2 TAP对中华鳖肝脏、脾脏抗氧化指标的影响

近年来，在评价水生动物的健康方面，利用组织抗氧化指标来反映动物机体损伤程度得到众多学者的广泛应用，其中重要的抗氧化因子包括SOD、CAT、GST、GSH、NOS、MDA等，其活性及含量可随外界胁迫而做出迅速响应。

SOD、CAT、NOS三者在机体的抗氧化和免疫保护方面有着密切的关系，共同组成了抗氧化防御系统的第一道防线。在本研究中，除肝脏CAT外，肝脏和脾脏SOD、CAT、NOS活性均在16.7 mg/kg剂量组达到最大值，显著高于对照组和其他实验组，均呈现先诱导后抑制的变化趋势。冯艳艳等在研究氟苯尼考对脊尾白虾()的免疫与抗氧化功能时也发现，低、中剂量的氟苯尼考对SOD、CAT有诱导作用，高剂量时则起到抑制作用。杨洪波也发现TAP对松浦镜鲤()脾脏NOS活力的影响，随着浓度增加具有先诱导后抑制的现象。上述研究与本实验结果一致。SOD、CAT、NOS活性的诱导，可能由于TAP刺激机体产生大量的活性氧簇，为了清除过多的氧自由基，活性增强；而随着药物浓度的增加或在高剂量的长时间作用下，产生的氧自由基超出了机体能清除的范围，TAP不能被完全排出体外，氧自由基攻击抗氧化系统，导致肝脏和脾脏代谢功能下降，SOD、CAT、NOS活性被抑制。

MDA是反映机体氧化应激性能的重要指标，能体现脂质过氧化程度。吝思琪等采用浸泡的方式研究了不同浓度(5、10 mg/L)的恩诺沙星对卵形鲳鲹抗氧化功能的影响，发现随着浓度的升高，肾脏MDA含量显著升高。王琨等报道，当鱼类肝脏、脾脏等实质器官发生病变时，机体会发生脂质过氧化反应，造成组织细胞的死亡，MDA含量显著升高。本研究也发现，中华鳖肝脏和脾脏MDA含量与药物浓度成正比，其含量的升高是脂质过氧化反应增强、脂质过氧化物增多的表现，说明高剂量的TAP对中华鳖的肝脏和脾脏可产生一定的损伤作用。

3.3 TAP对中华鳖组织损伤的影响

MAITA等报道以TAP200 mg/(kg·d)体重的饲喂雄性大白鼠，4周后通过组织学观察可见精原细胞和精细胞的大量退行性变化，可引起繁殖障碍。MAGGINI等用TAP150 mg/(kg·d)的对ASHP小鼠进行肌肉注射3周，发现肺组织粗面内质网的核糖体片段发生改变。本研究通过组织病理对中华鳖8个不同组织器官观察发现，在16.7 mg/kg剂量组时，中华鳖肠道、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、精巢、睾丸、肌肉与对照组相比，并无显著的病理变化，而随着给药剂量的增加，TAP对中华鳖以上各组织的损伤逐渐加重。表现为肠绒毛脱落，肾结构模糊，肝血窦扩张、大量炎性细胞浸润，脾脏小梁动脉出现炎症，心肌纤维萎缩、崩解，精巢和睾丸生殖细胞质消失，肌纤维断裂、肌束间隙增大。本研究结果与MAITA等、MAGGINI等的报道相似，说明过量服用TAP对中华鳖各个组织器官均可造成严重的损伤，在养殖过程中应严格遵守规范的用药剂量。

综上所述，高剂量的TAP对中华鳖具有较强的毒性，对血液生理生化、组织免疫酶活性均产生抑制作用，导致机体的抗氧化功能下降。从病理组织学也可以看出，高剂量TAP对中华鳖的消化器官、排泄器官、循环器官、免疫器官、生殖器官均可造成严重的损伤，具有一定的生殖毒性。虽然在整个试验过程中未发现中华鳖的死亡现象，但如果中华鳖长期过量使用TAP，可能会对其生长、生殖产生危害。因此，在实际的中华鳖疾病预防和治疗过程中，应该严格控制TAP的用药剂量，谨防过度使用或者滥用，以免对中华鳖机体造成损伤。