DEHP对斑马鱼仔鱼HPG和HPA轴相关功能基因表达的影响

刘 飞，王 凡，郑雅婷，李萌萌，冉娜娜，高晓杨，石亚男，朱娜娜，程惠敏，杨 瑞

(洛阳师范学院，河南洛阳 471934)

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一种邻苯二甲酸型乙酰丙烯类的化学物质。因其成本低廉、可塑性较强、相容性高、兼容效果好等优点，被广泛应用于医用产品(医疗器材、一次性外科消毒手套等)、日常用品(玩具、雨衣等)中，来增强塑料制品的可塑性。DEHP通过范德瓦尔斯力或氢键与塑料分子形成不稳定的结构，因此，它容易通过清洗等方式进入空气、水体或其他物质之中。在高温制作或者燃烧塑料制品过程中，DEHP由于蒸汽压低也可通过烟尘等方式释放到环境之中。随着我国对DEHP这类邻苯二甲酸类化学物质重视程度加强，有关地表水中含有DEHP的研究被不断报道出来。鱼类处于水生捕食链中较高营养级，并且终生生活在水中，极易受到水中环境污染物的影响，因此，开展DEHP对鱼类影响的研究是很有必要的。

斑马鱼()是一种与人类基因有着高度同源性，被广泛应用于毒理学、病理学及药理学研究中的理想模式生物。已有研究表明，DEHP对斑马鱼具有内分泌、免疫、遗传、肝脏等毒性。然而在鱼类整个生命周期中，一般认为鱼的早期生命阶段(从受精卵生长发育至仔鱼阶段)是对外在污染物的干扰作用的最敏感阶段，主要是由于这一阶段的鱼为补偿因污染物干扰作用而引发体内一系列生化反应的能力与成鱼相比较弱。目前发现DEHP对斑马鱼这一生命阶段影响的研究较少，仅发现DEHP可导致斑马鱼胚胎/仔鱼发育畸形甚至死亡，干扰下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴从而致使甲状腺激素升高。

DEHP与天然甲状腺激素3,30,5-三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)的某些生理功能类似，其代谢产物结构与内源性雌激素具有一定的相似性，所以，DEHP对内分泌系统干扰的影响深受关注。研究环境污染物对鱼类内分泌系统的影响，主要研究其对鱼类三条主要内分泌轴[下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)、HPT轴]的影响。因此，本实验开展DEHP斑马鱼胚胎/仔鱼阶段HPG轴和HPA轴的相关功能基因表达影响的研究，以期揭示其对斑马鱼内分泌干扰的分子机制。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼的繁殖

2月龄野生型斑马鱼经过本实验室养殖到5月龄性成熟后进行繁殖。养殖期间，温度保持在26～28 ℃，每天投喂3次新鲜孵化的丰年虫。斑马鱼的繁殖过程如下：选择健康成熟的雄性和腹部膨大的雌性斑马鱼作为亲本，繁殖前一晚将雌雄亲本按1∶1放置在斑马鱼繁殖交配盒(上海海圣生物实验设备有限公司)中，并用隔板隔开，避光过夜。次日清晨开灯并将隔板抽去。40 min后，吸出交配盒中杂质，用鱼卵捞网(上海海圣生物实验设备有限公司)收集鱼卵，放置于培养皿中，用海盐水清洗胚胎，然后用体视显微镜观察，剔除不正常的胚胎。将盛有胚胎的培养皿暴露于(27±1)℃的恒温培养箱中进行胚胎暴露实验。

1.2 斑马鱼的胚胎毒性实验

实验前，用丙酮作为助溶剂将DEHP配制成高浓度的母液。实验中所用相应浓度的暴露液由高浓度母液经胚胎培养水稀释而得，暴露液中的丙酮小于暴露液体积的0.01‰。DEHP暴露处理液的名义浓度依次为10、30和300 μg/L，对照组为0.01‰ 丙酮。使用150 mm的培养皿作为实验的暴露容器，每个浓度设置5个生物学平行，每个培养皿加入50 mL暴露液，200枚发育正常的胚胎，然后再将其放在光照培养箱中进行暴露实验，暴露实验期间用一次性吸管及时吸出停止发育或者死亡的胚胎和仔鱼。在胚胎受精后96 h，吸除培养皿中杂质，用专用鱼苗捞网随机捞取各培养皿中的仔鱼50尾，吸干水分后，置于装有RNA保存液(RNAlater)的EP管中，4 ℃过夜后再放置在-80 ℃冰箱中保存，以备后续实验所用。

1.3 斑马鱼仔鱼的总RNA抽提及逆转录

取出上述装有斑马鱼仔鱼样品的EP管，待样品解冻后，依据RNA提取试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)上的步骤提取各样品中的总RNA，抽提完成后测定各样品的/值，结果显示均在1.8～2.0之间，同时，用凝胶电泳分析显示28 S的亮度和宽度是18 S的2倍左右，表明RNA质量较好。

按照反转录试剂盒(东洋纺反转录试剂盒)中的步骤将RNA反转录成cDNA，对于浓度不在100～250 ng/μL的RNA样品，在反转录之前用DNase/RNase-free ddHO进行不同比例稀释，然后用超微量分光光度计测定其浓度。反转录过程中，首先65 ℃预变性5 min，以提高后续反转录效率。将变性后的RNA样品与5X RT Buffer、RT Enzyme Mix、Primer Mix和Nuclease-free Water配置成20 μL的反转录反应体系，混匀后放置于梯度PCR仪中进行反转录反应。

1.4 Real-Time PCR

斑马鱼β-actin(内参)、HPG轴和HPA轴的相关功能基因(19、2、3、-、-和-基因；、、2、、和基因)的引物序列来自于相关文献报道，详见表1。

表1 PCR所用基因的引物序列

根据实时荧光定量试剂盒(德国DBI生物科技公司)中操作步骤，将反转录后的cDNA样本与相应基因上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix和无菌ddHO配成20 μL的RT-qPCR反应体系，混匀后，放到实时荧光定量PCR仪中对各基因进行扩增。

1.5 数据分析

采用2法对RT-qPCR反应后获得的Cq值进行分析，运用Excel 2016分析计算各目的基因mRNA的相对表达量。然后再利用SPSS 13.0软件进行One-Way ANOVA分析，并用最小显著差数法(LSD法)分析对照组和处理组之间的差异。若<0.05，则表示差异显著；<0.01，则表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 DEHP对斑马鱼早期发育阶段HPG轴相关基因表达的影响

DEHP对斑马鱼早期生命阶段生殖轴的相关功能基因(19、2、3、-、-和-基因)表达影响的RT-qPCR结果见图1。与垂体相关的芳香化酶基因19、下丘脑相关的促性腺激素释放激素基因3、垂体相关的雌激素受体基因-和-在DEHP质量浓度为30 μg/L时表达量显著升高，依次升高了116%、191%、132%和267%；下丘脑相关的促性腺激素释放激素基因2在各DEHP处理组表达量显著升高，依次升高了82%，208%和91%。垂体中的卵泡刺激素基因-在各DEHP处理组表达量无显著差异。以上结果表明，DEHP显著升高了斑马鱼早期生命阶段HPG轴的相关功能基因的表达。

图1 DEHP对斑马鱼仔鱼HPG轴的相关基因表达的影响(n=5)

2.2 DEHP对斑马鱼早期发育阶段HPA轴相关基因表达的影响

DEHP对斑马鱼早期生命阶段肾上腺轴的相关功能基因(、、2、、和基因)表达影响的RT-qPCR结果见2。HPA轴的相关功能基因(基因除外)在各DEHP处理组表达量显著降低，其中，下丘脑和垂体相关的阿黑皮素原基因依次降低了68%、68%和55%，垂体中盐皮质激素受体基因依次降低了75%、78%和57%，肾上腺中的黑素肾上腺皮质激素2受体基因2依次降低了46%、79%和55%，下丘脑中的促肾上腺皮质激素释放激素基因依次降低了76%、82%和65%，垂体中的糖皮质激素受体基因依次降低了52%、54%和72%。垂体中的促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白基因在各DEHP处理组表达量无显著差异。以上结果表明，DEHP显著降低了斑马鱼早期生命阶段HPA轴的相关功能基因的表达。

图2 DEHP对斑马鱼仔鱼HPA轴的相关基因表达的影响(n=5)

3 讨论

鱼类生殖内分泌系统的调控主要就是通过鱼类的HPG轴完成，主要过程为：首先由下丘脑依据机体生理功能的需要释放不同类型的促性腺激素释放激素(GnRHs)作用于鱼类的垂体的相应部位上，后者通过合成并释放促性腺激素(GTH)作用于性腺，进而有效调控鱼类的生殖。鱼类的促性腺激素依据功能的不同又可分为促黄体素(LH)和促卵泡激素(FSH)。19、-和-是生殖内分泌系统中性激素合成相关功能基因，主要是在性腺和脑中表达。由于DEHP代谢产物结构与内源性雌激素具有一定的相似性，因此，通过测定HPG轴的相关功能基因表达量可探讨DEHP对斑马鱼早期生命阶段生殖内分泌干扰的分子机制。

2和3是促性腺激素释放激素家族中的重要成员，其中3仅鱼类中发现。2和3对鱼类生殖内分泌系统起重要作用，其靶器官为垂体，通过2和3的合成与释放来调控垂体中FSH和LH的合成与释放，进而抑制或促进性腺激素的合成与释放。本研究中，DEHP处理组的2和3表达量上升，这可能会导致性激素的合成发生改变。19是芳香化酶，是细胞色素p450中的一种，在鱼类生殖内分系统中主要作用是催化雄激素转化为雌激素，在雌激素的合成中起到关键作用。在本研究中，与对照组相比，30 μg/LDEHP处理组19表达量显著性升高，这可能会导致E2/11KT比例增加。ERs是与雌激素特异性结合的受体分子，二者的结合是雌激素生理作用发挥的前提，进而调控生物体生殖等生理过程。本研究中，-和-的表达量在30 μg/LDEHP处理组显著性升高，进一步表明了DEHP能够导致斑马鱼胚胎/仔鱼E2/11KT比例增加。另有研究表明，HPG轴和HPT轴间存在着交互作用，贾盼盼的研究报道了DEHP增加了斑马鱼胚胎/仔鱼HPT轴和TH浓度相关基因的表达。因此，DEHP也有可能通过HPT轴间接作用于HPG轴从而导致HPG轴的相关功能基因的表达。以上这些结果表明，DEHP不仅可以直接作用于斑马鱼胚胎/仔鱼的HPG轴，也可间接作用于HPG轴，影响其相关功能基因的表达，从而干扰鱼类的生殖内分泌系统。

HPA轴是神经内分泌系统的重要组成部分，下丘脑受到刺激会分泌促肾上腺皮质激素释放激素(Crh)，Crh可以诱导垂体释放促肾上腺皮质激素(Acth)，进而作用于肾上腺皮质合成糖皮质激素(主要是皮质醇)；Crh还可促使Acth的前体阿黑皮素原(Pomc)水解。Acth也可作用于黑素肾上腺皮质激素2受体(Mc2r)，加速肾上腺糖皮质激素的合成和分泌。促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(Crhbp)能够与Crh结合使其失活，从而影响机体的内分泌。盐皮质激素受体基因()和糖皮质激素受体基因()都属于类醇激素受体,是HPA轴负反馈的主要调控者。目前，关于DEHP对斑马鱼HPA轴的影响的研究尚未被报道。本研究中，斑马鱼胚胎暴露于DEHP 4 d之后，、、、2和基因表达水平在DEHP处理组显著降低，说明在DEHP的刺激下，斑马鱼下丘脑基因的表达量下降，其诱导垂体释放的Acth下降，同时，的下降也促使Acth的前体Pomc水解，进而反馈于Pomc，使基因转录水平下降。另外，下降的Acth调节Mc2r的合成，致使2基因表达的降低，进而影响肾上腺糖皮质激素的合成和分泌。DEHP的刺激也抑制了斑马鱼和基因的表达量，下降的和也会负反馈调控HPA轴。有研究显示，化学物质可以通过降低斑马鱼体内E2的浓度来降低皮质激素的浓度，而本研究的结果显示DEHP可能会增加斑马鱼体内的E2的浓度，这表明DEHP对斑马鱼早期生命阶段的HPA轴的影响并没有通过对HPG轴的影响而间接作用于HPA轴，可能是通过直接作用于HPA轴而引起的。

4 结论

通过DEHP对斑马鱼的胚胎/仔鱼阶段的暴露实验发现，DEHP导致HPG轴上相关基因显著上调，HPA轴上相关基因显著下调。这表明DEHP对斑马鱼胚胎/仔鱼阶段的2个主要内分泌分子通路的影响将会导致内分泌功能的改变，从而可能影响斑马鱼的后期生长发育。