包药珠核对提高淡水有核珍珠育珠效果的初步研究

李晓红，詹 毅，虞 立，金伟锋

(1.浙江中医药大学，杭州 310053；2.安徽省新贝生态农业发展有限公司，浙江诸暨 311800)

三角帆蚌()是我国主要的淡水育珠蚌，广泛地分布于安徽、浙江、江苏和湖北等地。育珠蚌在进行插核手术后，伤口极易感染病菌，致使育珠蚌吐核甚至死亡，让珍珠养殖户遭受经济损失。为了提高珍珠的产量和品质，很多研究者从育珠环境、外套膜细胞的培育、术前术后处理以及细胞小片的处理等方面对有核珍珠培育技术做了大量的研究和实践工作。也有研究者对珠核的材质和固核技术进行探索和研究，李咏梅等将珠核用处理液浸泡后再植入育珠蚌体内，取得了很好的育珠效果。从现有的研究来看，尚未有研究者使用珠核表面包裹药物，制成包药珠核，将具有消炎抗菌、滋养育珠蚌的作用。

为了降低育珠蚌死亡率，很多养殖户向水面泼洒抗生素或者投喂含有抗生素的饵料，以达到消炎抗菌的目的。长此以往，不仅污染了水体环境，也危害到人类的健康。因此，药物配方和用药方式对于提高珍珠的品质和保持生态环境尤为重要。由于中药含有的多种有效成分具有抗菌消炎，增强机体的免疫能力的功能，可以有效解决耐药性和药物残留的问题，目前已广泛地应用于水产养殖。多项研究表明，中药黄芪所含有的黄芪多糖能有效增强动物的非特异免疫活性，促进动物生长。黄霉素具有毒性低，不易与其他抗生素产生拮抗作用，安全性高等特点，是国家认定的动物“绿色”饲料添加剂。

近年来，很多学者将向后反馈神经网络(back propagation neural network,BPNN)模型与遗传算法(genetic algorithm,GA)的寻优功能相结合来研究中药有效成分提取工艺条件优选的问题。由于在训练模型的过程中追求拟合误差的最小化，导致网络中隐层神经元数目增多，使网络模型出现过度拟合。同时，传统BP神经网络的权值往往会使算法陷入局部极值，导致网络训练失败。而利用遗传算法的全局寻优功能，优化神经网络的结构，并利用全局寻优功能，找到全局最优解，更加符合包药珠核各药物浓度之间非线性的特征。本实验对珠核包衣中黄芪药液的适宜浓度、黄霉素和土霉素的药液的适宜浓度进行测试，以育珠蚌死亡率、成珠率、优质珠率为指标，采用遗传神经网络算法，以期探索一种新型包药珠核的生产工艺方法，优化包衣中各种药物成分的配比提高淡水珍珠的品质。

1 材料与方法

1.1 材料

选取体质健康、体长100～130 mm的2龄三角帆蚌为育珠蚌，体长50～80 mm的1龄蚌制做细胞小片，均由浙江省诸暨山下湖珍珠养殖基地培育。

珠核由淡水丽蚌壳研磨而成，正球形，直径2.5 mm，表面光滑，符合质量要求。制作包药珠核的药物[黄霉素(批号：11015-37-5)、土霉素(批号：031161018)和中药材黄芪(批号：1731213)]均购自江山市万里中药材有限公司。

1.2 包药珠核的制做

称取3 600 g干燥的黄芪，切片后放入过滤袋，扎紧袋口并留有一定空余，放入装中药煎药机玻璃桶，加入6 000 mL清水浸泡30 min。设置高火煎煮20 min，转文火煎煮30 min，过滤，收集滤液，查看药液体积，如不足1 800 mL，则在药液中加入清水至1 800 mL，冷却至常温备用。取黄霉素18 g溶于180 mL清水，土霉素18 g溶于20 mL浓度95%的乙醇溶液。将配置好的三种药液混合，则混合药液中黄芪生药浓度为1.8 g/mL，黄霉素的浓度为9 mg/mL，土霉素的浓度为9 mg/mL。类似的，可以配制正交实验组其他方案所需的混合药物。

将珠核放入注有清水的滚筒中滚动清洗三次，洗去表面粉尘，再放入超声波清洗机中继续清洗30 min，洗去残余粉尘。清洗后的珠核放入沸水中煮40 min灭菌消毒，然后置于烘箱60 °C干燥。将处理好的珠核浸没在不同浓度混合的药液中，每隔10 min搅拌一次，常温下浸泡30 min，取出，放于烘箱中烘干，即得包药珠核。

1.3 外套膜插核手术

将育珠蚌刷洗干净，放于清水池中10 h左右，让母蚌排除体内污泥和粪便等。将蚌体固定在手术台上，用开壳器缓慢将蚌壳撑开约10 mm，加塞。用开口针在外套膜后端靠近腹缘处开口，口径与深度以能放入一个珠核和一个细胞小片为宜。从小片贝上切下用来做细胞小片的外套膜，滴上红药水进行杀菌，将外套膜去掉边缘触手，再切成长度约为0.8 mm的小片，用送针将干燥的珠核与黏在一起的细胞小片从开口处移植到育珠蚌体内，每只育珠蚌植核30颗，两侧各15颗。术后将育珠蚌吊养在育珠水塘，育珠期8个月，每个星期检查一次，去除死蚌。

1.4 正交实验设计

以黄芪生药的浓度、黄霉素的浓度和土霉素的浓度为影响因素，以育珠蚌的成活率、留核率和优质珠率为指标，安排实验。设一对照组，植入经消毒干燥处理过的无药珠核，重复3组，每组用蚌100只。实验组采用三因素四水平正交实验设计方案，黄芪生药的浓度分别为0.9、1.2、1.5、1.8 g/mL，混合药液中黄霉素的浓度分别为6、7.5、9、10.5 mg/mL，土霉素的浓度分别为7.5、9、10.5、12 mg/mL。实验组共16组，重复3组，每组用蚌100只。

1.5 数据的收集与处理

1.5.1 育珠蚌的成活率、留核率和优质珠率

育珠期结束后，分别统计对照组和实验组育珠蚌存活的数量、留核数以及优质珍珠数，按下列方法计算各组成活率、留核率和优质珠率。

育珠蚌的成活率=100%×育珠期结束后活蚌的总数量/育珠蚌的总数；

留核率=100%×成活的育珠蚌留核总数/成活的育珠蚌植核总数；

优质珠率=100%×优质珍珠数/收获珍珠的总数。

优质珠的衡量标准具有多样性，聘请经验丰富的珍珠养殖专家以及权威机构，对收获的珍珠从光泽度、形状、直径、光洁度四个方面进行品质鉴定，选出优质珍珠。

1.5.2 基于熵权法的珍珠品质综合评价指标的确定

熵权法是基于信息学的理论，通过计算指标的信息熵决定指标的权重的一种客观赋权法。指标的变异性越大，所起的作用也越大，其权重也就越大。熵权法能够消除信息之间的重叠性，深刻反映出指标信息熵值的效用价值，具有较高的可信度和精确度。本实验先采用熵权法确定指标存活率、留核率和优质珠率的权重分别记为，，，再按照式(1)将它们进行线性加权合并为一个综合评价指标。

=++

(1)

1.6 遗传神经网络优化模型的建立

利用实验得到的统计数据，以神经网络理论为基础，利用遗传算法优化隐层神经元的个数和网络权值，建立药用珠核生产工艺的遗传神经网络数学模型，再用遗传算法的全局寻优功能，搜索最优生产工艺组合。

1.6.1 数据预处理

因实验因素和实验指标的量纲不同，因此在建立数学模型进行数据分析之前，先对数据按公式(2)进行归一化处理，去除量纲和数量级对分析结果的影响，归一化后的数据位均于[0,1]之间。

1.6.2 GA-BP神经网络

BP神经网络由输入层、隐层和输出层构成，具有简单、计算量小等优点。但是，由于训练开始时，系统中网络权值、阈值、隐层神经元的个数等参数的设置具有随机性，易导致训练误差增大或出现过拟合的现象。遗传算法(Genetic Algorithm,GA)是一种基于自然选择和种群遗传机理的全局优化搜索算法。通过模拟种群个体在遗传过程中的选择、杂交和突变，实现适者生存，从而找到最佳个体。

GA-BP神经网络先随机生成一个初始权值种群，并对种群中的个体进行二进制编码。然后，根据权值的适应度值，用GA算法对权值进行更新，淘汰劣的个体，留下优的个体再组合成新一代种群，不断重复上面的过程，逐步得到最优解。GA-BP神经网络算法可以有效地提高预测的精度和处理问题的速度，缩短网络的训练时间。基于遗传神经网络算法搜寻包药珠核最佳生产工艺条件的具体方案如下：

将实验数据归一化处理，为了提高网络的收敛性和泛化能力，采用留一交叉验证方法，把所有正交实验数据随机分为训练集和测试集；设置遗传算法运行参数，利用遗传算法优化BP神经网络结构，根据个体适应度值，确定隐层神经元的个数；利用遗传算法优化BP神经网络各层之间的权值。根据网络结构，对网络的权值进行编码，并生成初始种群。根据个体适应度值，不断地运行选择、交叉和变异算子，生成新种群，直至满足标准，得到最优初始权值；再利用遗传算法的全局寻优功能，对得到的BP神经网络搜索最优解，得到制作包药珠核各药物的最优浓度组合。

利用Matlab14.0软件对实验结果进行计算和分析，按照熵权法的步骤，计算育珠蚌的死亡率、留核率、优质珠率的权重和综合评价指标。设双侧显著性检验<0.05，利用卡方独立性检验，比较对照组和实验组、重复组之间的死亡率、留核率和优质珠率是否有显著性差异。借助Matlab14.0工具箱，设计遗传神经网络算法程序，以黄芪生药浓度、黄霉素浓度、土霉素浓度为输入，以综合评价指标为输出，搜索包药珠核药物的最佳浓度。

2 结果

2019年，于浙江省诸暨市山下湖珍珠养殖基地进行实验，育珠期为3-11月，期间日平均气温约为12.7～29.8 ℃。11月底，剖蚌取珠，分别统计对照组和所有实验组存活蚌的总数、留核总数和优质珠总数。植入无药珠核的对照组育珠蚌存活率为(85.0±2.6)%，留核率为(70.3±2.9)%，优质珠率为(60.6±2.4)%。

2.1 正交试验设计的方案和结果

以黄芪药液浓度、黄霉素浓度和土霉素浓度为因素，设计三因素四水平正交试验方案，各因素和水平见表1。

表1 正交试验设计的因素和水平

熵权法确定、和分别是0.352 0，0.271 7，0.376 3，根据公式(2)计算珍珠品质的综合评价指标。正交试验设计的方案、结果和综合评价指标值见表2。

表2 正交试验方案及结果

经卡方检验，16个实验组的育珠蚌存活率、留核率和优质珠率均明显高于对照组，但3个重复组间无显著性差异。

2.2 包药珠核的最佳工艺条件的确定

以黄芪药液浓度(g/mL)、黄霉素浓度(mg/mL)、土霉素浓度(mg/mL)为网络输入，以综合评价指标为网络输出，建立GA-BP神经网络模型，采用留一法将16组实验数据分为测试集和验证集，所有变量经过标准化处理。利用遗传算法，对神经网络进行训练，确定隐层神经元个数和优化网络权值，再对建立的神经网络进行全局寻优，得到包药珠核各药物的的最佳浓度。

2.2.1 确定BP神经网络结构

设定初始种群的大小为20，隐含层为1层，训练的次数为20次，训练的适应值为0.001。经过训练，隐层神经元的数量与平均训练误差和平均预测误差的关系如图1所示。

图1 神经元的数量与绝对误差

从图1可以看出，随着隐层神经元数量的增加，虽然平均测试误差不断减小，但是当神经元数量为3时，平均验证误差最小，之后逐渐增大，出现过拟合现象，因此取隐层神经元的个数为3。以NMSE作为遗传算法的适应度值，对神经网络进行训练，确定网络权值和阈值，当训练到15代时，训练集与验证集的最大绝对误差为1.476，达到了预计值，拟合优度=0.86。训练误差和验证误差如图2(a)所示，预测值与实际值的关系如图2(b)所示。

图2 GA-BP神经网络训练与预测结果.

2.2.2 最优生产工艺

基于上述建立好的GA-BP网络模型，利用遗传算法的全局寻优功能，实现对最优生产工艺组合的自主搜索，得到包药珠核混合的最佳药物浓度:黄芪生药浓度为1.55 g/mL，黄霉素药液浓度为7.9 mg/mL，土霉素药液浓度为9.48 mg/mL，综合评价指标可以达到94.49 %。

3 讨论

3.1 包药珠核规格对珍珠品质的影响

本实验中所用到的珠核直径均为2.5 mm，如果珠核的直径变大，每只育珠蚌的植核数量将会减少，用于制作包药珠核的最佳药物浓度也会相应地发生改变。以6 mm直径珠核为例，如果按本实验中的最佳药物浓度制作包药珠核，育珠蚌的存活率和留核率大大降低，对育珠蚌解剖的结果发现，部分珍珠囊破损，珠核脱落，其原因可能是大珠核附着的药物比较多，黑化细胞小片并腐蚀珍珠囊壁，引起育珠蚌药物中毒。因此对于不同规格的珠核，药物的浓度也不一样。

3.2 包药珠核促进育珠蚌伤口愈合

育珠蚌植入2.5 mm的普通珠核后，一般需要10 d左右伤口可以愈合，而植入同规格的包药珠核后，伤口在3～5 d即可愈合。极大的降低了伤口感染致病菌的几率，减少坏珠的数量，提高留核率。同时，中药黄芪的益补作用可以更快地促进育珠蚌珍珠质的分泌，提高优质珠的数量，缩短育珠时间。

3.3 药物浓度对珍珠品质的影响

基于珍珠养殖户长期养殖经验的基础上，实验选取的药物浓度范围安全可靠，不会造成育珠蚌中毒死亡，而且实验结果(图3)也表明，在此浓度范围内，育珠蚌的存活数量并没有明显的变化。然而，留核率和优质珠率随着黄芪浓度、黄霉素浓度和土霉素浓度的升高，表现出先增加后减小的特点。从对育珠蚌的解剖结果来看，过高的药物浓度导致细胞小片黑化，腐蚀珍珠囊，增加脱核数。所以，优化包药珠核的药物浓度对于提高珍珠的品质十分重要。此外，中药黄芪因产地、采收时间和贮藏条件的不同，药效也会有所不同。因此在选取黄芪时，应根据黄芪的质量标准，尽量选取道地药材。多项研究表明，山西的蒙古黄芪中黄芪甲苷、总黄酮、多糖的含量高于其他产地的黄芪，因此本实验选用了山西蒙古黄芪。

图3 黄芪药液浓度、黄霉素浓度、土霉素浓度与存活率、留核率、优质珠率的关系

3.5 外界环境对存活率、留核率及优质珠率的影响

育珠蚌的存活率、留核率及优质珠率与外界的气候条件和育珠水域环境密不可分。水体的pH值，含菌量、养料的多少可以人为地进行调控，但是水温是不可控的因素之一，夏季的持续高温或冬季的持续低温，会增加育珠蚌的死亡率，并影响育珠蚌珍珠质的分泌。育珠水域的生态环境也会影响到珍珠的养殖，近年来，广大养殖户积极探索鱼蚌混养的生态养殖方式，鱼类可以为蚌类提供丰富饵料，减少有机肥和化肥的施用；蚌类可以净化水体，二者相容共生，不但降低了投资成本，提高社会效益和生态效益，也有利于促进水域的健康和可持续性发展。