RNF181、cyclin D1、Ki-67在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

梁伊灵 付星玮 李晓波 薄威 张忠 黄波 王旭光 王柏芳 张珉

【摘要】 目的：研究環指蛋白181（ring finger protein 181，RNF181）、cyclin D1、Ki-67在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达水平及其临床病理学意义。方法：采用免疫组织化学染色法检测83例NSCLC组织及癌旁组织中RNF181、cyclin D1、Ki-67的蛋白表达情况并分析其临床病理意义。结果：在NSCLC组织中RNF181主要定位于细胞浆，在肺癌组织中普遍低表达;cyclin D1、Ki-67主要定位于细胞核，在癌组织中相对高表达。不同肿瘤分化患者NSCLC组织中RNF181表达、cyclin D1阳性、Ki-67表达情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;不同局部淋巴结转移患者NSCLC组织中RNF181表达、cyclin D1阳性情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。不同年龄、性别、病理类型患者NSCLC组织中RNF181表达、cyclin D1阳性、Ki-67表达情况及不同局部淋巴结转移患者NSCLC组织中Ki-67表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。NSCLC组织中RNF181表达与cyclin D1、Ki-67均呈负相关（rs=-0.373、-0.417，P<0.001），cyclin D1与Ki-67表达水平呈正相关（rs=0.526，P<0.001）。结论：RNF181在NSCLC组织中低表达，cyclin D1、Ki-67在NSCLC组织中高表达分别与肿瘤进展相关，并随肿瘤分化程度或局部淋巴结转移情况不同而存在差异，三者蛋白表达水平存在相关性。

【关键词】 RNF181 cyclin D1 Ki-67 非小细胞肺癌 肿瘤进展

[Abstract] Objective： To study the expression levels and clinicpathological significance of ring finger protein 181 （RNF181）， cyclinD1 and Ki-67 in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Method： Immunohistochemical staining was used to detect the expression of RNF181， cyclin D1 and Ki-67 in 83 cases of NSCLC and adjacent cancer tissues， and their clinicopathological significance was analyzed. Result： In NSCLC tissues， RNF181 was mainly located in the cytoplasm and generally low expression in lung cancer tissues; cyclin D1 and Ki-67 were mainly located in the nucleus and relatively high expression in cancer tissues. There were significant differences in the expression of RNF181， cyclin D1 and Ki-67 in NSCLC tissues of patients with different tumor differentiation （P<0.05）; there were significant differences in the expression of RNF181 and cyclin D1 in NSCLC tissues of patients with different local lymph node metastasis （P<0.05）. There were no significant differences in RNF181 expression， cyclin D1 positive expression and Ki-67 expression in NSCLC tissues of patients with different age， sex and pathological classification and Ki-67 expression in NSCLC tissues of patients with different local lymph node metastasis （P>0.05）. The expression of RNF181 in NSCLC was negatively correlated with cyclin D1 and Ki-67 （rs=-0.373， -0.417， P<0.001）， cyclin D1 was positively correlation with Ki-67 expression （rs=0.526， P<0.001）. Conclusion： The low expression of RNF181 in NSCLC tissues， the high expression of cyclin D1 and Ki-67 in NSCLC tissues are respectively related to tumor progression， they vary with the degree of tumor differentiation and local lymph node metastasis， and the expression levels of these three proteins are correlated.

[Key words] RNF181 cyclin D1 Ki-67 Non-small cell lung cancer Tumor progression

First-author’s address： Basic Medical College of Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.03.009

肺癌是常见的恶性肿瘤，据统计仅在2018年就有约209万新发病例，且约有176万人死于肺癌，占癌症总死亡人数的五分之一[1-3]。其中80%都属于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），由于筛查方案不足和临床症状出现较晚，大多数患者诊断时已为晚期疾病，因此患者预后通常很差[4-6]。为此，寻找调控NSCLC进展的关键分子，明确其分子机制，将有利于肺癌的早期诊断及靶向治疗，从而降低病死率。

环指蛋白181（ring finger protein 181，RNF181）基因包含716个碱基，编码153个氨基酸，其在胚胎发育过程中及胰腺、肝脏、肾脏等25种组织中均有表达[7-8]。现已发现RNF181在多种肿瘤组织中表达，但其对肿瘤进展的调控作用尚不十分明确，且存在争议[9-13]，尤其在NSCLC组织中的表达情况及临床病理意义尚无报道。G1/S-特异性周期蛋白D1（cyclin D1）、增殖标志物Ki-67（Marker of Proliferation Ki-67，Ki-67）在NSCLC等多种肿瘤组织中高表达[14-15]，并与肿瘤进展过程密切相关。本研究旨在通过检测NSCLC组织中RNF181、cyclin D1及Ki-67的表达情况，分析这三种蛋白表达的临床病理意义及相互关系，探讨它们在肿瘤进展过程中发挥的作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年6月-2020年12月辽宁省肿瘤医院经病理诊断确诊的83例NSCLC标本，其中男54例，女29例;年龄39～87岁，平均（60.23±8.36）岁;肺鳞癌29例，肺腺癌54例;出现局部淋巴结转移45例。以上所有病例手术前均未接受任何放射治疗及化学药物治疗。本研究已经沈阳医学院医学伦理委员会批准。

1.2 免疫组织化学染色

1.2.1 主要试剂 PBS磷酸盐缓冲液（pH值7.2～7.6）、抗原修复缓冲液（柠檬酸法，pH值6.0）、内源性过氧化物酶阻断剂、非免疫山羊血清封闭液、即用型免疫组化EliVision plus试剂盒（鼠/兔）、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒等均购于福州迈新生物技术开发有限公司，RNF181（F-2）单克隆抗体（鼠抗人）、cyclin D1（A-12）单克隆抗体（鼠抗人）、Ki-67（Ki-67）单克隆抗体（鼠抗人）均购于美国Santacruz公司。

1.2.2 方法 NSCLC组织标本经10%中性福尔马林固定后，进行石蜡包埋，制作成厚度为4 μm的组织切片，所有切片均在统一条件下进行后续实验，操作方法如下：（1）切片放入二甲苯及梯度酒精脱蜡水化;（2）加入柠檬酸钠（pH值6.0）抗原修复液，通过高压热修复法进行抗原修复;（3）经PBS洗涤后滴加过氧化物酶阻断剂，湿盒放入30 ℃孵箱中恒温孵育20 min;（4）PBS洗涤后，滴加非免疫山羊血清进行抗原封闭;（5）滴加一抗：RNF181（1∶650），cyclin D1（1∶150），Ki-67（1∶200），经4 ℃过夜孵育，同时采用PBS代替一抗作为空白对照;（6）滴加EliVision plus试剂盒中反应增强液，恒温30 ℃孵育20 min;（7）PBS洗涤后，滴加酶标抗小鼠/兔IgG聚合物，30 ℃恒温孵育28 min，再次PBS洗涤;（8）二氨基联苯胺DAB结合辣根过氧化物酶显色;（9）苏木素复染细胞核;（10）脱水、透明、封片、镜检。

1.2.3 结果判定标准

1.2.3.1 RNF181 在每张RNF181免疫组织化学染色切片中，随机选取10个视野（×400），并随机计数200个细胞，进行阳性结果判定。RNF181定位于细胞浆，根据染色强度，无颜色变化为0分，浅黄色为1分，棕色为2分，深棕褐色为3分;根据染色范围：阳性细胞数<10%为0分，10%～25%为1分，26%～75%为3分，76%～100%为4分。两项评分相乘为最终评分（0～12分），<6分为RNF181低表达，6～12分为RNF181高表达。

1.2.3.2 cyclin D1 cyclin D1主要定位于细胞核，阳性表达为棕色或黄色颗粒，在高倍镜下进行观察，随机选取10个视野（×400），并随机计数200个细胞，按照阳性细胞所占比例进行评分，核着色阳性率大于5%为cyclin D1阳性，反之记为cyclin D1阴性。

1.2.3.3 Ki-67 Ki-67定位于细胞核，阳性表达为棕色或黄色颗粒。在高倍镜下进行观察，随机选取10个视野（×400），并随机计数200个细胞，按照阳性細胞所占比例进行评分，小于30%记为Ki-67低表达，30%及以上记为Ki-67高表达。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;相关性分析采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNF181、cyclin D1、Ki-67在NSCLC组织中的表达 83例NSCLC组织中，RNF181主要定位于细胞浆，见图1A、1B，其中42例（51%）为低表达，RNF181在癌旁肺组织中呈中高表达;cyclin D1主要定位于细胞核，见图1C、1D。cyclin D1阳性主要出现在NSCLC组织中，癌旁肺组织普遍呈阴性表达;Ki-67主要定位于细胞核，见图1E、1F。Ki-67阳性主要出现在NSCLC组织中，癌旁肺组织普遍呈阴性或低表达。PBS空白对照见图1G。不同肿瘤分化患者NSCLC组织中RNF181表达、cyclin D1阳性、Ki-67表达情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;不同局部淋巴结转移患者NSCLC组织中RNF181表达、cyclin D1阳性情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。不同年龄、性别、病理类型患者NSCLC组织中RNF181表达、cyclin D1阳性、Ki-67表达情况及不同局部淋巴结转移患者NSCLC组织中Ki-67表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1、2、3。

2.2 NSCLC组织中RNF181、cyclin D1、Ki-67蛋白表达水平相关性分析 对RNF181、cyclin D1及Ki-67在NSCLC组织中的蛋白表达水平进行Spearman相关性分析，发现RNF181表达与cyclin D1及Ki-67表达均呈负相关（rs=-0.373，-0.417，P<0.001），cyclin D1表达与Ki-67表达呈正相关（rs=0.526，P<0.001）。

3 讨论

RNF181（RING finger protein 181）又称为HSPC238，基因定位于染色体2p11.2[8]，其基因组含有153个氨基酸编码716个碱基[16]，分子质量18kDa，属于环指蛋白超家族，具有RING型结构域[17]，在多种组织中都有表达。现有的研究发现，RNF181可能通过整联蛋白aⅡbβ3（Integrin aⅡbβ3）或泛素-蛋白酶等途径发挥各种复杂的调控作用[18]。本研究发现，RNF181蛋白主要定位于细胞浆中，不同局部淋巴结转移、肿瘤分化患者NSCLC组织中RNF181表达比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。这提示RNF181可能对NSCLC进展发挥抑制作用。应当指出，RNF181对肿瘤进展的调控作用尚不十分明确，相关报道亦存在矛盾之处。与本研究发现相似，有研究报道了RNF181在弥漫大B细胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺浸润性导管癌中低表达并与肿瘤进展及不良预后相关[9-10，19-23]。与之相反，部分基于肠癌及三阴性乳腺癌的研究发现这些肿瘤中RNF181的蛋白表达水平均高于正常组织，并可通过调控Hippo信号通路或ERα对肿瘤进展发挥促进作用[12-13，24-25]。上述看似矛盾的研究结果提示：在不同肿瘤组织中，由于RNF181上、下游分子表达及活化水平不同，可能进一步影响到RNF181的表达及其对肿瘤进展的调控作用，其具体分子机制尚需进一步深入研究。

Ki-67主要表达于细胞核内，是全面反映细胞增殖活性的可靠指标。其功能与细胞的有丝分裂及细胞周期相关[26-27]。Ki-67在细胞增殖周期中除G0期外的各期中均有表达，且在细胞增殖结束后会迅速降解，是目前被广泛应用于检测细胞增殖状态的标记物之一[28-31]。现有研究发现Ki-67高表达与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的分化程度、临床病理分期、局部淋巴结转移及不良预后等指标相关[14]，提示Ki-67的表达情况是反映肿瘤进展的重要指标。本研究亦发现：不同肿瘤分化患者NSCLC组织中Ki-67表达情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。这与现有研究发现相吻合，提示其可对NSCLC进展发挥促进作用。

cyclin D1为细胞周期相关蛋白，为细胞周期的启动因子，也是生长感受器[15]。cyclin D1可与CDK4等蛋白结合，激活CDK激酶活性，促进细胞从G1到S期转换，加速细胞增殖[32]。此外，cyclin D1还可通过调控细胞侵袭能力促进肿瘤转移[33-34]。cyclin D1常在肺癌中高表达，且与肿瘤pTNM分期、局部淋巴结转移及不良预后等临床病理指标相关[35-39]。本研究亦发现，不同肿瘤分化、局部淋巴结转移患者NSCLC组织中cyclin D1阳性情况比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。提示其可对NSCLC进展发挥促进作用。

本研究发现在NSCLC组织中，RNF181表达与cyclin D1、Ki-67表达均呈负相关（P<0.001），而cyclin D1表达与Ki-67表达呈正相关（P<0.001）。现有肿瘤研究对上述三种分子表达相关性的报道不尽相同，与本的研究发现类似，Wang等[11]研究发现胃癌组织中RNF181、cyclin D1表达水平负相关，RNF181通过ERK/MAPK/cyclin D1/CDK4通路抑制胃癌进展。有研究报道乳腺癌组织中cyclin D1、Ki-67表达水平呈正相关[40]，而鳞状上皮肿瘤中，因P16表达情况不同，cyclin D1及Ki-67的表达可分别呈负相关或正相关[41-42]。上诉研究结果提示：受到多种上、下游分子的影响，RNF181、cyclin D1及Ki-67之间可能存在复杂的交互作用，并进一步调控肿瘤的进展过程。

综上所述，RNF181在NSCLC组织中相对低表达，cyclin D1、Ki-67在NSCLC组织中相对高表达，三者表达水平存在相关性，并随肿瘤分化程度或局部淋巴结转移情况不同而存在差异，其各自或协同对肿瘤进展的调控作用及分子机制尚需进一步深入研究。

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（收稿日期：2021-04-22） （本文编辑：程旭然）