蜂王浆中甾体激素类物质检测分析研究进展

李 铮 杨 静 焦丽丽 李 慧 吴 巍

(1. 长春中医药大学，吉林 长春 130000；2. 通化吉通药业有限公司，吉林 通化 134000)

蜂王浆(Royal Jelly，RJ)，又名蜂皇浆、皇浆，是工蜂咽腺分泌的一种浆状物质[1]，具有抗衰老[2-3]、调节生育[4]、调节内分泌系统[5]等功效。在蜂王浆中除水分、蛋白质、碳水化合物、脂类(脂肪酸)等成分外[6]，还存在一类小分子化合物甾体激素，这类化合物对人体的功能调节具有十分重要的作用[7]。

甾体激素又称类固醇激素，是一类四环脂肪烃化合物，其母核为环戊烷多氢菲。已有研究表明在RJ中存在多种甾体激素，如雌二醇[8-11]、雌三醇[8-9]、雌酮[8-9,12]、孕酮[10,12]、睾酮[10-11]、糖皮质激素[13-15]等。这些甾体激素在胆固醇和脂肪酸的代谢[16-17]、抑制早期肝癌发展[18]、降低冠心病发病率[19]、降低子宫出血和子宫内膜癌风险[20-21]等过程中起到关键作用。但甾体激素是RJ中的痕量激素，提取难度大，因此鲜有关于RJ甾体激素检测的研究报道。文章拟综述国内外关于RJ甾体激素检测技术的研究现状，以期为构建一种简便、快捷、准确应用于检测RJ甾体激素的方法提供理论支撑。

1 RJ中甾体激素检测前处理方法

目前有关RJ中甾体激素的前处理并没有特殊方法，以常规激素类成分前处理方法为主。激素类成分常用的前处理方法为：液液萃取法[22-23]、固相萃取法[24]、QuEChERS[25-26]、微波辅助萃取法[27]、固相微萃取法[28]等，前3种方法在RJ甾体激素的提取中应用较多。

1.1 液液萃取法

曹均等[10]将RJ用少量水进行水解后，加入无水乙醇萃取，可得到雌二醇、睾酮、孕酮3种甾体激素。Sidor等[11]将RJ用适量蒸馏水溶解后，在组织匀浆器中(15 000 r/min)匀浆2 min, 4 ℃下以10 000 r/min离心20 min，上清液用0.45 μm尼龙注射器过滤，4 ℃保存。采用液液萃取法操作简便、处理样品量大，但该法耗时较长、有机溶剂消耗量大[29-30]。

1.2 固相萃取法

王强[9]在提取RJ中雌激素时，以乙酸钠溶液作为缓冲液，乙腈、乙酸乙酯作为提取液，随后用Oasis HLB小柱和Bond Elut-NH2小柱进行连续净化，二氯甲烷—甲醇为洗脱液，可得到雌二醇、雌三醇、雌酮等雌激素。Ma等[12]在研究中用固相萃取法对蜂蜜中的雌激素进行提取，用试剂将样品溶解后在HLB柱上上样，以乙酸甲醇混合液淋洗，10%甲醇—乙酸乙酯、甲醇—氨水洗脱，洗脱液吹干后复溶，可得到雌酮、孕酮。刘素琴等[13]采用固相萃取法对蜂蜜中的雌激素进行提取，将HLB柱活化上样后，用10%甲醇水、10%甲醇氨水、20%四氢呋喃水进行淋洗，洗脱液吹干复溶，可得到雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、己烷雌酚和双酚A 6种雌激素。钱艳等[14]将RJ经乙酸铵缓冲溶液、β-葡萄糖醛酸苷酶、甲醇等溶剂溶解处理后，HLB柱吸附，适当比例甲醇、水淋洗后，甲醇洗脱，洗脱液过氨基柱，得到氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙等7种糖皮质激素。固相萃取法的有机溶剂消耗少，既可做到富集又可除杂，但该法缺乏专属性与专一性。

分子印迹技术(MIT)是固相萃取方法之一，以某一特定的所需分子为模板分子，制备具有高选择性聚合物[31]。Dong等[32]将模板分子与功能单体甲基丙烯酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸及引发剂偶氮二异丁腈混合后采用紫外光照法引发聚合，制得的分子印迹聚合物可用于污水中的雌激素的检测。采用紫外光照法制备的分子印迹聚合物均能够从污水、牛奶、肉制品中检测出雌激素，且浓度范围内线性良好，可应用于实际检测中[33-35]。区别于其他固相萃取法，MIT具有良好的机械强度和热稳定性、耐酸碱性、专属性、专一性，非常适合分离富集复杂样品中痕量成分。目前，该技术已被广泛应用于中药研究的部分领域，主要包括中药中有效成分的提取分离、净化富集、成分测定及活性成分筛选等方面[36-37]。综上，该技术可应用于RJ中甾体激素的检测。

1.3 QuEChERS法

QuEChERS是一种以基质固相分散为基础的快速样品处理技术，该技术操作简单，目前在农残检测中较为常用[38-39]。张文文[8]将RJ溶于乙酸锌溶液以沉淀蛋白，用适量乙腈、二氯甲烷萃取上清液，随后加入盐包Na2SO4，PSA作为净化材料去除RJ中极性物质，以丹磺酰氯—丙酮溶液作为衍生化试剂，得到雌二醇、雌三醇、雌酮。李璐等[15]采用QuEChERS技术对蜂蜜中的糖皮质激素进行提取。以乙腈作为提取溶剂，PSA、C18作为固相萃取剂，获得甲基泼尼松龙等糖皮质激素。该法回收率高、准确度高、溶剂消耗少，但净化效果较差且缺乏专一性。

1.4 其他方法

微波辅助萃取法具有溶剂消耗少、萃取时间短、有机物完全分解、样品提取多等优点[40]。Hibberd等[41]采用该法对河流沉积物中的雌激素进行萃取，首先以甲醇为萃取剂并进行微波加热，随后采用固相萃取法净化样品，最后进行衍生化，成功得到雌酮、雌二醇、雌三醇。该法需要对样品进行加热，但RJ受热易分解，因此该法尚未应用于RJ前处理。

固相微萃取法比固相萃取法所需样品量更小，溶剂消耗量更少，并且可达到集分离、浓缩、进样于一体的效果[42]。姚键梅等[43]通过衍生瓜环固相微萃取搅拌棒法结合HPLC-UV可检测出动物源性食品中“痕量”雌激素。邓鑫雨等[44]制备MIL-101(Cr)填充针头式过滤器并结合HPLC-FLD对水中雌激素进行分离富集，在试验范围内线性良好。目前微波辅助萃取法和固相微萃取法均未见应用于RJ中甾体激素的检测，因此可进一步研究这两种方法应用于RJ甾体激素检测的可能性。

综上，在RJ前处理过程中，液液萃取法一般以乙酸钠、乙酸铵为缓冲溶剂，乙腈为萃取剂，固相萃取法一般选用HLB小柱吸附，淋洗液多选用甲醇混合溶液，洗脱液多选用甲醇—乙酸乙酯。RJ经过前处理，可获得甾体激素，其中固相萃取法效果最佳，这是由于该法可以同时完成样品的分离和富集，提高了检测灵敏度，缩短预处理时间、节省溶剂且重现性好[45]。由此认为固相萃取法可作为提取RJ中甾体激素的前处理的最优方法。但普通的固相萃取法仍存在缺乏专一性、回收率不高、样品损失等问题，由此认为采用具有高专属性、高选择性的分子印迹技术作为前处理方法,能够更好地提取富集目标化合物，利于检测。

2 RJ中甾体激素检测分析方法

目前，甾体激素的分析检测方法包括高效液相色谱—质谱法(HPLC-MS)[46-48]、气相色谱—质谱法(GC-MS)[49-50]、放射免疫测定法[51]、酶联免疫吸附法[52]等。

2.1 HPLC-MS法

HPLC-MS技术具有操作简便，耗时少等特点[53]。王强[9]采用高效液相色谱—四级杆时间飞行质谱法(HPLC-Q-TOF MS)对RJ中的雌激素进行检测，选用C18色谱柱，以甲醇和水作为流动相进行梯度洗脱，选用ESI-作为离子源，以多反应监测模式进行质谱扫描，该方法无衍生，最终结果显示检出限(LOD)为2.4～5.0 μg/kg，定量限(LOQ)为5.2～10.6 μg/kg，回收率为64.5%～86.3%。张文文[8]通过HPLC-MS/MS检测RJ中的雌激素，选用C18色谱柱，以0.1%甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，选用ESI+、ESI-作为离子源，以多反应监测模式进行质谱扫描，最终结果显示LOD为0.015～0.020 ng/kg，LOQ为0.1 ng/kg，回收率为80.7%～113.0%。在实际237批次RJ样品中检测出了雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇以及雌酮4种雌激素，其中17β-雌二醇检出率最高。Ma等[12]采用超高效液相色谱—质谱法对蜂蜜中甾体激素进行检测，色谱柱选用C18，以氨水及乙腈甲醇混合液为流动相，选用ESI-为离子源，以多反应监测模式进行质谱扫描，结果表明该方法的LOD为0.01～0.33 μg/kg，加样回收率为71.2%～99.7%。刘素琴等[13]采用超高效液相色谱—质谱法对蜂蜜中甾体激素进行检测， 选用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18作为色谱柱，以氨水及乙腈甲醇混合液为流动相，选用ESI-作为离子源，以多反应监测模式进行质谱扫描，结果表明LOD和LOQ分别为0.04～0.19 μg/kg和0.15～0.62 μg/kg,6种雌激素加标回收率为78.5%～112.9%。李璐等[15]采用超高效液相色谱—质谱法对蜂蜜中甾体激素进行检测，选用C18色谱柱，以乙酸水(含0.1%)作为流动相，选用ESI+作为离子源，以多反应监测模式进行质谱扫描，结果表明41种糖皮质激素LOQ为0.55～3.90 μg/kg，加样回收率为83.9%～111.2%。钱艳等[14]采用液相色谱—质谱法对RJ进行检测，色谱柱选用C8，流动相为乙腈和水，选用ESI+作为离子源，以多反应监测模式进行质谱扫描，结果表明LOD均为10 μg/kg，加样回收率为84.7%～100.0%。

2.2 GC-MS法

GC-MS具有检测识别特异性，但需要对所检测的样品进行衍生化，在此过程中待测样品可能出现一定量的损失[54]。王强[9]利用GC-MS分析RJ中雌激素，选用HP-5 MS石英毛细管色谱柱，载气为高纯He，恒流脱气，选用EI作为离子源，以离子监测模式进行质谱扫描，除上述操作外，试验前需使用吡啶和衍生化试剂对目标产物进行衍生化，结果表明LOD为1.8～3.3 μg/kg，LOQ为5.3～7.4 μg/kg，回收率为63.5%～75.5%。

2.3 其他方法

放射免疫法(RIA)指利用同位素标记的抗原和未标记的抗原与抗体发生竞争性抑制反应，从而检测生物体内各种物质的方法。曹均等[10]采用放射免疫法对RJ中3种雌激素(雌二醇、睾酮和孕酮)进行分析检测，操作如下：取经过前处理包含待测物的上清液加入闪烁液一并放入闪烁仪中进行测定，三者平均含量分别为4.167，1.082，1.167 μg/kg。

酶联免疫是基于抗原与抗体的特异性非放射性反应的方法[55]。Sidor等[11]严格使用酶联免疫(ELISA)检测试剂盒证明了该法可测试蜂制品中睾酮和雌二醇的活性，研究表明蜂王浆中睾酮平均含量为1.961 μg/kg，雌二醇平均含量为289.98 μg/kg。此外，Swart等[56]、Manickum等[57]均采用酶联免疫吸附法检测出污水中含有雌酮、雌二醇、雌三醇等雌激素，且检测限均到达0.2～5.0 ng/L，因此，酶联免疫法是一种有效检测雌激素的分析方法。

在采用放射免疫法时，由于不同厂家所提供的RIA试剂盒准确性会出现差异，且该技术操作复杂，因此该法不利于检测[58]。酶联免疫吸附法容易出现假阳性，导致定量检测准确度降低。HPLC-MS、GC-MS等分析方法近年来较为常用，具有高灵敏度、低检测限等优点，但甾体激素本身具有难以挥发的特性，使用GC-MS法时在进样前需要对样品进行衍生化，不仅费时费力，还会在一定程度上造成样品损失，因此HPLC-MS是最适合检测RJ甾体激素的方法。

3 总结与展望

目前关于蜂王浆的研究较多，而甾体激素作为峰王浆中一种“痕量”成分却鲜有人开发利用。分子印迹技术作为前处理方法能够有效提高目标化合物富集率，高效液相色谱—质谱作为检测手段能够更快捷、更灵敏地检测出目标化合物。因此，以分子印迹技术与高效液相色谱—质谱为基础，建立出一套拥有良好方法学考察结果的分析方法或将成为接下来的研究重点。